높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과
Summary
우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.
Abstract
이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 구체적으로 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 (GFP) 감지의 표현 하도록 설계 되었습니다. 에이즈-1 기자 바이러스 (에이즈-1 개 그-iCre)는 Cre recombinase 매트릭스와 개 그 polyprotein의 capsid 단백질 V-1 게놈으로 삽입 하 여 생성 됩니다. 다음 대상 셀에 발표 바이러스 입자로 Cre recombinase의 포장에서이 결과 라인 Cre recombinase 활성화 빨간 형광 성 단백질 (RFP) GFP 스위치 카세트를 안정적으로 표현. 기저 상태에서이 카세트만 RFP를 표현합니다. 목표 셀에 Cre recombinase의 배달, 다음 loxP 사이트에 의해 형벌 RFP, GFP 식 결과 excises. 이 분석 결과 어떤 억제제 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 셀 및 셀 감염 시스템에서 테스트를 사용할 수 있는 그리고 HIV-1 바이러스 막 융합의 비 발한 억제제로 purinergic 수용 체 길 항 근의 클래스를 식별 하는 데 사용 되었습니다.
Introduction
소설 항 레트로 바이러스 치료를 위한 필요 에이즈-1의 억제제에 대 한 높은 처리량 스크린의 개발을 자극 했다. 개 그-iCre 기자 분석 결과 특히 호스트 세포 막1바이러스 막 융합을 측정 하 여 셀 감염 시스템에서 융해 단계에서 바이러스 항목의 억제제를 식별 하기 위해 개발 된다. 분석 결과 개발 되었다 바이러스 막 융합의 지점까지 에이즈-1 감염의 초기 단계에서 구체적으로 행동 하는 비 발한 억제제에 대 한 화면으로. 한 도전-셀 감염 측정은 새로운 감염을 측정 하는 것은 입력된 셀에서 차별 어렵다 그래서 초기 inoculum 감염된 기증자 세포와 ininfected 대상 셀 포함. 이상적인 시스템 분리 유전자 마커를 대상 세포 감염의 개시에 의해 유도 될 수 있다 포함 하 고 기증자 세포에 존재 하지 않습니다. 인기 있는 바이러스 내용을 바이러스 성 단백질 효소 퓨전, 연기-Vpr에 따라 분석 결과 혼합 효과적일 수 있다, 그러나 높은 처리량, 셀 심사2에 대 한 제한이 있다. 이 분석 결과 베타-lactamase (연기) 리포터 유전자를 에이즈-1 Vpr을 융합, virions로 포장 이며, 바이러스 성 막 퓨전 시 대상 세포에 전달이 포함 됩니다. 기판 CCF2 오전 대상 세포의 세포질에 로드 하 고 분열 시 형광 변화를 겪 습. CCF2 오전 기판 비싼 이며, 높은 처리 화면에 대 한 금지 될 수 있습니다. 기증자 및 대상 셀을 구별 하기 위하여 그것은 염료 레이블에 필요한 대상 인구. 마지막으로, 프로토콜 화합물의 큰 숫자를 테스트 하는 경우 부담 하 고 비용이 많이 드는 될 수 있는 몇 가지 세척 및 인큐베이션 단계를 요구 한다.
개 그-iCre 분석 결과 높은 처리량 셀 전송에서 퓨전의 억제제에 대 한 검사를 개발 하는 것이 문제에 해결책으로 개발 되었다. 이 시스템은 기판 셀으로 로드할 수 필요 하지 않습니다. 분석 결과 셀 무료 연구에도 사용할 수 있습니다 그리고 의사 형식화 된 HIV-1 개 그-iCre 바이러스 입자를 사용 하 여 다른 바이러스 성 융합 연구에. 그러나 에이즈-1 개 그-iCre 분석 결과3,,45마찬가지로 이러한 실제 바이러스 입자를 사용 하지 않는 HIV 환경을 중재-셀 퓨전 분석 바이러스 환경을 단백질 중재 세포 융합, 측정할 수 있습니다. 이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경으로 읽을 수 있습니다. 그것은 FDA 라이브러리 뿐만 아니라 purinergic 억제제1,6의 작은 도서관을 화면으로 성공적으로 사용 되었습니다. 다른 수 사관 들도 보고 바이러스 캡슐화 beta lactamase 세포질7,8 로 전송 하는 적응 하 고 최적화 된 높은 처리량 퓨전 분석 결과 사용 하 여 HIV-1 융합 저 해제 purinergic 식별 .
개 그-iCre 바이러스는 매트릭스와 에이즈-1 효소 사이트9에 의해 형벌 capsid Cre recombinase 삽입 개 그-iGFP 바이러스에 유사한 방식으로 설계 되었습니다. Cre 효소 성숙 hiv-1 프로 테아 제 초기 바이러스 입자 내에서 활성화 되 면 개 그 polyprotein 내에서 삽입 하는 전조로 이루어집니다. 따라서, Cre 납품은를 대상 셀 을 통해 바이러스 성 막 융해 과정에 효소 활성화 HIV-1 입자의 내용 전달에 의존 합니다. 프로토콜의 두 가지 버전은 여기에 제공 됩니다. 첫 번째는 에이즈-1 감염 인구를 사용 하 여 직접 셀 전송의 HIV 연구 대상 세포를 감염. 두 번째 버전 셀 무료 바이러스를 사용 하 여 셀 무료 바이러스 감염 연구. 셀 전송 분석 결과 셀은 이미 해 동 하 고 passaged 세포를 해 동 하는 날 로부터 7 일 또는 5 일 걸립니다. 경우에 세포를 해 동 하 여 passaged 셀 무료 감염 분석 결과 5 일 셀 해 동 될 필요가 있는 경우 및 3 일에서 수행할 수 있습니다. 지침은 또한 Clevers 랩10에 의해 만들어진 플라스 미드를 사용 하 여 원하는 셀 형식 (해당 되는 경우 기존의 RG 대상 셀 라인은 사용 하지 않는)에 RG (빨강-녹색) 대상 셀 라인을 생성 하 주어진 다. 적절 한 biosafety 주의 바이러스와 바이러스 표현 셀이 분석이 결과에 찍힌다는 것이 좋습니다. 우리는 BSL2 + 조직 문화 시설에서이 분석 결과의 감염 부분을 수행합니다. 셀 고정 후 표준 흐름 cytometry 및 현미경 시설에서 분석할 수 있습니다.
소설 화합물에 대 한이 분석 결과의 응용 프로그램 화면을 설명 하는 여기 HIV-1 바이러스 막 융합 (그림 1)을 억제. Purinergic 수용 체는 프로-염증 성 중재자. 우리 연구소는 비 선택적 억제제 purinergic 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 퓨전6의 행위로 설명 했다. 우리는 높은 처리량이 분석 결과의 활용 소설 HIV-1 바이러스 막 융합 억제제를 식별할 수 있는 것을 보고 합니다. Purinergic 클래스의 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 융합 억제제의 새로운 클래스를 나타냅니다 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
개 그-iCre 분석 결과 바이러스 성 복제의 융해 단계를 억제 수 있습니다 약물 후보 심사에 대 한 매우 도움이 될 입증 되었습니다. 이 분석 결과 수행할 때 좋은 신호를 얻을 가장 중요 한 단계는 대부분의 바이러스 감염 분석 유사. 첫 번째 중요 한 단계는 좋은-품질 바이러스의 높은 titers 생산 하 고 있다. 이 단계에서는 293T 세포 passaged 자주 (적어도 모든 48 h x 1) 그래서 그들은 될 overconfluent와 함께…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH/NIAID AI112423와 벤자민 K. 첸을 NIH/NIGMS GM113885와 탈리 아 헤 Swartz에 NIH/NIAID K08-AI120806 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 아이 칸 학교 의학의 마운트 시 나이 학장의 흐름 Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D5546 | Media for 293 Cells |
| RPMI-1640 | Sigma Aldrich | R0883 | Media for Jurkats |
| Fetal Bovine Serum Albumin | Gibco | 16140-071 | Serum for 293 Cells |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.03 | Serum for Jurkat Cells |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | Penn/Strep used in both media |
| T75 Flasks | Corning | 3073 | Used for Culture of Jurkat Cells |
| 10cm Tissue Culture Plates | Corning | 430167 | Used for Culture of 293 Cells |
| 96 Well Plates (tissue culture Treated) | Corning | 3595 | Used for fusion assay |
| Polyjet Transfection Reagent | Signagen | SL100688 | Used to transfect 293 Cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-100ML | Used in wash steps |
| Hyclone Trypsin Protease | GE Healthcare Life sciences | SH30042.01 | For Trypsinization of 293 cells |
| Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | For Nucleofection of Jurkats |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare Life sciences | 17144002 | For Nucleofection of Jurkats |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | For all tissue culture |
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | For all tissue culture and liquid handling steps |
| Millex Syringe Filter (0.45 micron) | Millipore | SLHA033 | For filtration of virus |
| BD Slip Tip Sterile syringes | BD Diagnostics | 309656 | For filtration of virus |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | 2b | for Nucleofection of Jurkats (various models available) |
| BD Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | for flow cytometry analyss of samples | |
| Tissue Culture Hood | Various models | Fortessa 2 | |
| pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE | Addgene | 32702 | Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011). |
| pCL10a1 | Novus Bio | NBP2-29542 | Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996) |
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