Summary
Per espandere la capacità dei laboratori in tutto il mondo per valutare l'ammissibilità dei pazienti con cancro del polmone per il trattamento con pembrolizumab, in modo affidabile e riproducibile, abbiamo sviluppato un test che utilizza il 22 3 anticorpo concentrato su un ampiamente disponibile immunohistochemical autostainer, per gli esemplari di biopsia e la citologia.
Abstract
Pembrolizumab in monoterapia è stato approvato per il trattamento di prima e seconda linea di pazienti con PD-L1-esprimendo avanzata di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Test per PD-L1 espressione con l'analisi diagnostica di PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22 3 compagno, che dà una percentuale di tumore Punteggio ottenuto (TPS), è stato convalidato il tessuto del tumore. Abbiamo sviluppato un test ottimizzato laboratorio-sviluppato (LDT) che utilizza il concentrato 22 3 anticorpo (Ab) su un autostainer IHC ampiamente disponibile per gli esemplari di biopsia e citologia. Il TPS PD-L1 è stato valutato con 120 sezioni di accoppiati insieme-tumore del tessuto e i campioni di biopsia e con 70 accoppiato i campioni di biopsia e citologia (lavaggi bronchiali, n = 40; le effusioni pleuriche, n = 30). Il 22 3 Ab che concentrato a base di LDT ha mostrato un alto tasso di concordanza tra biopsia (~ 100%) e citologia (~ 95%) esemplari quando confrontata con IHC PD-L1 espressione valutata mediante il saggio di 22 3 compagno IHC PD-L1 a entrambi TPS taglio punti (≥ 1%, ≥ 50%). LDT ottimizzato presentato qui, usando il concentrato di Ab 22 3 per determinare l'espressione di PD-L1 in entrambi il tessuto del tumore e in campioni citologici, si espanderà la capacità dei laboratori in tutto il mondo per valutare l'ammissibilità dei pazienti con NSCLC trattati con pembrolizumab in monoterapia in modo affidabile e riproducibile.
Introduction
Recenti studi clinici hanno dimostrato l'efficacia di pembrolizumab, un anticorpo di isotipo monoclonale umanizzato di kappa IgG4 che blocca l'interazione tra la morte programmata delle cellule 1 (PD-1) ed i suoi ligandi, PD-L1 e L2-PD, nel trattamento di pazienti con avanzato NSCLC1,2,3,4.
Attualmente, pembrolizumab è approvato per il trattamento di NSCLC PD-L1-esprimendo in entrambi i pazienti naïve al trattamento con un'espressione di PD-L1 TPS di ≥ 50% e nessun recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) o aberrazioni di linfoma anaplastic della chinasi (ALK) tumore genomico3 e per precedentemente trattati pazienti con un TPS PD-L1 di ≥ 1%1.
PD-L1 espressione proteica rilevata da IHC è stato ampiamente usato come analisi predittiva biomarcatore per terapie anti-PD-1/PD-L1. Negli studi clinici di pembrolizumab, il PD-L1 TPS ottenuti con formalina di campioni di tessuto paraffina (FFPE) è stato determinato utilizzando il PD-L1 IHC 3 22 compagno test5. Questo test è stato approvato da la US Food and Drug Administration (FDA) ed è stato marcato CE in Europa per la determinazione del tumore PD-L1 TPS5.
Ulteriori opzioni globali attraverso istituzioni per valutazioni affidabili e di alta qualità del TPS PD-L1 con LDTs che usare il concentrato di 22 3 anticorpo sono essenziali per sostenere le decisioni cliniche in materia di ammissibilità paziente per pembrolizumab trattamento. Un gran numero di laboratori di patologia non hanno accesso per il dosaggio di PD-L1 IHC 22 3 diagnostico compagno. Di conseguenza, lo sviluppo di affidabili e coerenti LDTs compatibile con piattaforme IHC autostainer ulteriori, ampiamente disponibili è essenziale.
Inoltre, c'è la necessità di stabilire LDTs usando campioni di citologia che sono il tipo di unico esemplare frequentemente disponibile da pazienti con NSCLC. Il dosaggio di compagno PD-L1 IHC 3 22 è convalidato per le resezioni, biopsie dell'ago e broncoscopie solo se la broncoscopia produce 100 cellule del tumore. Anche se spesso si ottengono i suddetti tipi di campione, campioni di citologia sono più facilmente raccolti e sono il tipo di campione più comunemente disponibile in alcune istituzioni6,7. Tuttavia, non c'è attualmente nessun test diagnostico convalidato disponibile per la valutazione dell'espressione PD-L1 in campioni di citologia; affidabile LDTs compatibile con campioni di citologia faciliterebbe ulteriori test di alta qualità PD-L1.
Inoltre, quando si stabilisce la validazione clinica di un LDT, l'IHC deve essere eseguita in modo simile ai test commerciale clinicamente validato corrispondente8. Per esempio, diversi passaggi critici devono essere verificate per ottenere lo stesso segnale in sezioni seriali quali titolazione di anticorpi, pretrattamento ritardi, tempi di incubazione e di sistemi di amplificazione9.
Recentemente abbiamo sviluppato un LDT ottimizzato che utilizza il concentrato 22 3 anticorpo per valutare l'espressione di PD-L1 su biopsie del tumore e citologia campioni10,11. Abbiamo trovato un'alta concordanza con la LDT contro il "gold standard" PD-L1 IHC 22 3 analisi10,11. Questo protocollo clinicamente validato sosterrà affidabile, di alta qualità PD-L1 test tra le regioni a livello mondiale.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico locale (Comitato di etica umana ricerca, Centre Hospitalier Universitaire de Nizza/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Questo protocollo è specificamente regolato per l'uso di 22 3 anticorpo concentrato su un commercialmente disponibile stainer IHC automatizzato (denominato per come autostainer qui, vedere la Tabella materiali) per le biopsie del tumore e campioni di citologia.
1. preparazione dei campioni di tessuto tumorale
- Difficoltà tessuto tumorale in formalina 10% neutra tamponata (NBF), in una cassetta.
Nota: Il tessuto del tumore dai tumori del polmone prossimale è generalmente ottenuto da bronchoscopy, eseguite sotto sedazione moderata da un pneumologo, o esperto del polmone. Per lesioni periferiche e affezione polmonare diffusa, è indicata una biopsia transbronchial o dell'ago. Queste procedure sono di solito fatto in una sala operatoria o unità di cure intensive. - Incorporare la cassetta in paraffina.
Nota: Fissazione può essere realizzata mediante aspersione o immersione immediatamente dopo la dissezione e in genere richiede 8-10 h. Il fissativo volume dovrebbe essere 15 – 20 x maggiore del volume di campione. Non è consigliabile risolvere il tessuto di biopsia per più di 10 h, poiché overfixation può causare mascheramento dell'antigene. La velocità di fissazione è di circa 1 mm/h a temperatura ambiente. - Infiltrare il campione di tessuto fisso con cera nel processore del tessuto (Vedi Tabella materiali).
Nota: Disidratazione viene eseguita in tre vasche di alcool con aumento delle concentrazioni di 70%, 85% e 90%. Acqua è finalmente rimosso da tre bagni di alcool assoluto finale. La compensazione viene eseguita in tre bagni di toluene e l'infiltrazione di cera in bagni di paraffina calda (44 – 60 ° C). - Incorporare il tessuto all'interno di uno stampo riempito con paraffina fusa (Vedi Tabella materiali) e attendere per solidificazione.
- Sezione del tessuto paraffina-incastonato con uno spessore di 3 μm su un microtomo.
- Trasferimento il nastro di paraffina per un bicchiere di carica positiva microscopio slide (Vedi Tabella materiali).
- Far asciugare il vetrino per 1h a 37 ° C.
Nota: Conservare le sezioni di tessuto a 2 – 8 ° C (preferito) o a temperatura ambiente fino a 25 ° C per preservare l'antigenicità e macchia entro 15 d di sezionamento.
2. preparazione dei campioni di citologia
-
Raccogliere i lavaggi bronchiali in una soluzione conservante (Vedi tabella materiali).
Nota: Per questo, viene utilizzata la tecnica standard broncoscopia.- La distribuzione del Bronco da campionare il lavaggio. Raccogliere il lavaggio in un recipiente pulito. Etichetta del contenitore con il paziente il primo e ultimo nome, data di nascita e origine del campione.
- Trasferire i lavaggi bronchiali a una provetta conica da 50 mL e aggiungere 2 g di DL-ditiotreitolo polvere (Vedi Tabella materiali), vortice il tubo per 30 min e poi lo Centrifugare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di una soluzione mucolitica (Vedi Tabella di materiale).
- Agitare il campione per 20 min a velocità media (livello 9) e centrifugare esso a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e depositare il pellet cellulare in provette contenenti 10% NBF.
- Aggiungere 4 gocce di un reagente di preparazione del blocco delle cellule (Vedi Tabella materiali) per il pellet cellulare.
- Trasferire il pellet cellulare su una videocassetta, risolvere il problema in 10% NBF e paraffina-incorporarlo per preparazione di blocco delle cellule e il sezionamento (vedere i passaggi 1.1 – 1,7).
3. PD-L1 macchiatura Assay
- Accendere l'autostainer e il computer.
- Fare doppio clic sull'icona autostainer e scegliere l'utente.
- Fare clic su 'Crea etichetta' e poi su 'Protocollo'.
- Fare doppio clic sul protocollo 22 3.
Nota: Il protocollo è prima installato sul computer di autostainer cliccando su «creare protocollo». Il protocollo completo è fornito come File supplementari 1. - Scrivere l'ID del paziente sull'etichetta e fare clic su 'Stampa'.
- Incollare l'etichetta sulla diapositiva.
- Aprire il cassetto di diapositiva premendo sul pulsante del cassetto che è stato scelto.
- Porre il vetrino con etichettato sul pad termico con l'etichetta rivolta verso Monte e verso l'interno.
- Chiudere il cassetto scorrevole.
- Togliere i tappi dai dispenser e caricare i reagenti sulle cremagliere dei reagenti.
- Aprire il cofano del coloratore e posizionare le cremagliere su Carosello dei reagenti assicurandosi che si adattano e tenere in posizione.
- Chiudere il cofano.
- Sul software, fare clic sullo strumento che verrà utilizzato e cliccare su 'Esecuzione'.
- Alla fine della procedura IHC, sciacquare il vetrino per alcuni secondi con l'acqua del rubinetto e una goccia di una soluzione di pulizia.
- Reidratare il vetrino con un bagno di etanolo al 100% e un secondo bagno di etanolo al 95% per alcuni secondi.
- Porre il vetrino nella macchina coprioggetto per un caricamento automatizzato del coprivetrino.
4. interpretazione della colorazione PD-L1
Nota: Un patologo qualificato dovrebbe eseguire l'interpretazione del test IHC PD-L1.
- Valutare la qualità della colorazione PD-L1 analizzando i controlli positivi e negativi prima dell'esame dell'esemplare del paziente.
Nota: I risultati ottenuti sul campione del paziente sono considerati non validi se la macchiatura dei controlli non è accettabile. - Confermare la presenza di un minimo di 100 cellule tumorali vitali sotto un microscopio.
Nota: Rapporto quando esemplare del paziente ha meno di 100 cellule del tumore. - A bassi ingrandimenti 4x, valutare tutte le zone di tumore ben conservato di positivi e negativi.
Nota: Un basso ingrandimento, colorazione parziale della membrana o membrana macchiatura di debole intensità (1 +) può essere difficile da riconoscere. - Punteggio di colorazione parziale o completa della membrana cellulare.
Nota: La macchiatura citoplasmica dev'essere escluso dall'interpretazione. - Calcolare il TPS valutando la proporzione delle cellule del tumore positivo PD-L1 rispetto a tutte le cellule del tumore presenti nelle aree del tumore ben conservato.
Nota: Solo le cellule vitali del tumore dovrebbero essere esaminate. Tutti gli altri elementi cellulari, quali cellule del sistema immunitario, le cellule necrotiche, le cellule normali e artefatti, devono essere esclusi dall'esame.
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Representative Results
Utilizzando la procedura presentata qui e come descritto in dettaglio in recenti pubblicazioni10,11 di questo gruppo, LDT ottimizzato è stato clinicamente validato con 120 campioni di biopsia FFPE NSCLC archivistici da pazienti sottoposti a chirurgia resezione o una biopsia presso l'ospedale universitario di Pasteur, Nizza, tra marzo 2007 e marzo 2016. Inoltre, per la valutazione dell'espressione di PD-L1 dei campioni di citologia, TPS è stata valutata in 70 campioni di biopsia del tessuto accoppiato e blocchi di celle che sono state preparate da lavaggi bronchiali (n = 40) o effusioni pleuriche (n = 30) (raccolti presso il Pasteur Ospedale dell'Università, bello, tra luglio 2014 e il 2016 di novembre). Tutte le diapositive erano appena tagliate e tinto entro 24 ore.
Un rappresentante che macchia il modello con biopsia campioni utilizzando il concentrato di 22 3 anticorpo (LDT), confrontato con il dosaggio di compagno di PD-L1 IHC 3 22 (gold standard) sono mostrati in Figura 1A e 1B. Utilizzando un TPS di ≥ 1%, 54/120 casi (45%) erano PD-L1 positivo, mentre usando un TPS di ≥ 50%, 29/120 casi (24%) sono stati considerati positivi per PD-L1.
Il coefficiente di correlazione intraclasse (ICC) usato per misurare la correlazione della partitura TPS come variabile continua era 99% tra LDT e il gold standard. Facendo uso di entrambi il TPS taglio punti di ≥ 1% e ≥ 50%, i punteggi κ per interpathologist accordo sono stati pari a 1 all'interno della piattaforma LDT.
Un rappresentante che macchia il modello con citologia esemplari usando l'anticorpo 22 3 concentrano su LDT confrontato con il kit di PD-L1 IHC 3 22 (gold standard) è mostrato in Figura 1 e 1 D. La percentuale di concordanza di 70 coppie di campioni di biopsia e citologia con LDT utilizzando uno del TPS taglio punti di ≥ 1% e ≥ 50% era superiore al 95% e l'ICC con il Punteggio di TPS come una variabile continua era tra 0,88 e 0.90. Questo risultato è stato coerenza in ogni tipo di campione di citologia (effusione pleurica vs. lavaggio bronchiale) o l'istologia del tumore (adenocarcinoma vs. carcinoma a cellule squamose) con un ICC tra 0.82 e 0,96. Quando si confrontano il TPS PD-L1 di 37 (su un totale di 70) coppie di campioni di citologia con LDT per i campioni di biopsia con il gold standard, la percentuale di concordanza utilizzando il ≥ 1% TPS o il ≥ 50% TPS taglio punto era superiore al 97% e l'ICC era tra 0,93 e 0.95.
Figura 1: rappresentante che macchia il modello sugli esemplari di biopsia e citologia utilizzando il concentrato di 22 3 anticorpo (LDT), confrontato con il PD-L1 IHC 22 3 kit (gold standard). (A), questo pannello mostra l'analisi di PD-L1 IHC 3 22 usata su una biopsia del tumore. (B) questo pannello mostra la LDT ottimizzata utilizzando il 22 3 anticorpo concentrato su sezioni seriali dalla biopsia del tumore stesso, come analizzato nel pannello A. (C), questo pannello mostra il dosaggio di PD-L1 IHC 3 22 in un blocco di celle. (D) questo pannello mostra LDT ottimizzato usando l'anticorpo 22 3 concentrarsi sulle sezioni di serie nello stesso blocco come analizzato nel pannello C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo convalidato un LDT ottimizzata utilizzando il concentrato di anticorpo del PD-L1 22 3, attraverso il confronto con il corrispondente test commerciale clinicamente validato10,11. 3 22 concentrato anticorpo-basato LDT ha mostrato un alto tasso di concordanza tra biopsia (~ 100%) e campioni di citologia (~ 95%) quando confrontata con l'espressione di PD-L1 IHC valutata mediante il saggio di PD-L1 IHC 3 22 a ≥ 1% TPS sia il ≥ 50% TPS taglio punti. Come recentemente raccomandato dall'associazione internazionale per la studio del cancro del polmone, le zone di PD-L1 positive dovrebbero essere lo stesso per circa 10 campioni negativi di PD-L1, 10 campioni positivi di PD-L1 e 20 campioni che coprono la gamma dinamica lineare della clinicamente validato PD-L1 IHC prova8. Abbiamo effettuato uno studio di validazione su 120 biopsie e 70 campioni di citologia. Nel complesso, la concordanza era alta, indipendentemente dal TPS taglio per positività, il tipo di campioni, o l'istologia del tumore. I risultati presentati qui sono d'accordo con quelli di altri studi precedenti che mostrano un alto tasso di concordanza per citologia e tessuto esemplari12,13,14,15.
In questo studio, tutti gli esemplari sono stati corretti in 10% NBF. Noi non ha valutato l'impatto di altri fissativi, mentre l'effetto sulla PD-L1 macchiatura di altri fissativi non-formalina come fissativi a base alcolica è attualmente inesplorati. La presenza di cellule immunitarie che esprimono PD-L1, in particolare i macrofagi, garantisce un'interpretazione attenta dei campioni di citologia. Questi campioni devono essere valutati con riferimento al seriale ematossilina ed eosina scivolo, e, in alcuni casi difficili, macchie complementari per valutare le cellule immuni possono essere effettuate per escludere qualsiasi interpretazione errata dell'espressione in cellule del tumore solo PD-L1.
Questo studio contiene una serie di limitazioni, tra cui un'analisi retrospettiva in una singola istituzione e il fatto che nessun paziente è stato curato con pembrolizumab per valutare il risultato clinico. Inoltre, una minore limitazione di LDT presentato qui riguarda il modello di macchiatura granulare che è stato osservato occasionalmente quando si utilizzano sistemi di amplificazione, che possono rendere più difficile la loro interpretazione. Inoltre, il modello di macchiatura delle cellule immuni è un po ' più intenso rispetto a quella osservata con il gold standard. La formazione dei patologi è necessaria ottenere una corretta interpretazione del PD-L1 macchiatura con IHC. 16
In ambito clinico, la robustezza del LDTs deve essere mantenuto nel tempo, cercando di certificazione e accreditamento, di seguenti procedure operative e partecipando regolarmente a valutazione esterna di qualità schemi8. La garanzia delle prestazioni predittive cliniche può essere assicurata solo quando questi prerequisiti sono compiuti8.
Il protocollo presentato qui gli indirizzi l'esigenza critica PD-L1 LDTs su campioni di citologia e biopsia quando analizzato su un autostainer ampiamente disponibile in aree geografiche che non possono essere equipaggiate con il dosaggio del gold standard. LDT qui presentato, che è stato ottimizzato utilizzando il concentrato 22 3 anticorpo, può essere utilizzato per valutare l'espressione di PD-L1 su citologia e biopsia campioni provenienti da pazienti con NSCLC. Questo amplierà significativamente il numero di laboratori che può offrire alta qualità PD-L1 test per identificare i pazienti con NSCLC che sono ammissibili per il trattamento con pembrolizumab in monoterapia, in maniera affidabile e riproducibile.
Un potenziale futuro orientamento è quello di valutare la fattibilità dell'utilizzo di altri tipi di campioni di citologia (ad es., gli esemplari da biopsie del fine-ago, FNA broncoscopia-guida, endobronchiale ultrasuono-guida FNA e spazzole bronchiale) con 22 3 anticorpo concentrato a base di LDTs.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sponsorizzato da Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, Stati Uniti d'America. I finanziatori non ha svolto ruolo nel disegno di studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
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