Summary
证明了一种基于液体冲击的气溶胶病毒取样方法。当与下游分子检测相结合时, 该方法允许对 bioaerosols 的病毒进行简便、灵敏的检测。
Abstract
该协议演示了一种针对病毒的自定义气溶胶采样方法。在该系统中, 负离子交换树脂与液体撞击式空气取样装置相结合, 有效地集中了 bioaerosols 的负电荷病毒。因此, 树脂在气溶胶取样工作流中充当额外的浓度步骤。然后直接从阴离子交换树脂中提取出病毒微粒的核酸, 得到的样品适用于分子分析。此外, 本议定书还描述了一个定制的气溶胶室, 能够在各种环境条件下产生带有病毒的 bioaerosols, 并允许对环境变量 (如温度、湿度) 进行连续监测,风速和气溶胶质量浓度。使用此协议的主要优点是增强了病毒检测的灵敏度, 这是通过与未修改的常规液体冲击器进行直接比较来评估的。其他优势包括可能集中各种负电荷病毒, 低成本的阴离子交换树脂 (每样0.14 美元), 并易于使用。缺点包括本议定书无法评估树脂吸附的病毒微粒的传染性, 并可能需要优化冲击器中使用的液体取样缓冲器。
Introduction
该方法的目的是提供一个高度敏感的气溶胶取样平台, 以促进分子检测的负电荷病毒从 bioaerosols。微生物, 包括病毒微粒, 可以在 bioaerosols 中存活1长时间。Bioaerosols 可以旅行较远的距离和保持生存能力和传染性, 这证明了军团的疾病爆发的起源于距离6公里的工业冷却塔从受影响的人和导致18人死亡2。通过 bioaerosols 介导的病毒向人类间接传播可能发生在多种环境中, 并已证明诺如病毒在学校和餐馆3、4爆发。同样, 气溶胶传播病毒可能发生在农业环境中, 如在猪和家禽养殖场, 这一传输路线被认为是一个主要因素在病毒的移动之间的生产设施5,6,7,8,9。
对病毒携带的 bioaerosols 的有效取样可以改善快速诊断和预防疫情的准备, 如在中国活动物市场 bioaerosols 检测到 H5 流感病毒的示威活动中所示, 以及美国10,11。目前的气溶胶取样技术涉及许多不同的粒子捕获原理, 可大致分为 impingers、旋风、撞击和过滤器12。在本议定书范围之外, 详尽地涵盖了这些平台对 bioaerosols 病毒取样的所有利弊;但是, 可以说, 大多数这些取样装置尚未针对病毒和噬菌体13的收集进行优化。此外, 病毒微粒的传染性往往受到负面影响, 液体 impingers 认为更有效地保持病毒传染性比取样设备, 如固体撞击或过滤器14。然而, 液体撞击的一个缺点是靶稀释效应, 这是因为病毒在收集容器中相对较大的体积 (通常是≥20毫升) 收集的。另一个重要的缺点是液体 impingers 的次优效率, 浓缩颗粒 < 0.5 µM 大小15。然而, 这些装置的捕获效率可以通过固定在固体基质上来改善, 因为固定化可以增强病毒核酸的保存和病毒传染性16,17。
我们以前已经证明, 阴离子交换树脂是一种有效的工具, 从液体基质中捕获和浓缩病毒, 包括 F RNA 噬菌体, 甲型肝炎病毒, 人腺病毒, 和轮状病毒18,19 ,20。根据制造商的定义, 在这项工作中使用的阴离子交换树脂是一种吸附聚苯乙烯强碱性阴离子交换树脂, 功能性季胺基团介导在液体介质中对阴离子的吸引和捕获21.因此, 阴离子交换树脂有望捕获病毒的净负表面电荷, 包括许多肠道病毒, 流感病毒和其他与公共和动物健康有关的病毒。
目前的协议涉及增加负离子交换树脂的液体冲击器。在该系统中, 树脂作为冲击器液中捕获的病毒微粒的二次浓缩步骤。核酸可以直接洗脱在小体积, 提供了一个浓缩样本的分子分析。因此, 该方法的主要优点是提高了病毒检测灵敏度, 主要是通过减少样本量。另外, 由于对负电荷病毒的固有非特定捕获, 该方法可能适用于检测大量感兴趣的病毒。对 A 型和 B 型流感病毒的疫苗株和 FRNA 噬菌体 MS2 (MS2) 进行了验证。这些病毒随后使用标准的 qRT PCR 方法检测, 如前所述22。终端用户不应期望在执行此方法时遇到困难, 因为对当前现有设备的修改不构成对常规气溶胶取样和分析流程的重大干扰。
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Protocol
1. 气溶胶室的设置 (见图 2)
-
预加载液体 impingers 与20毫升0.01 米磷酸盐缓冲盐水, pH 值 7.5 (PBS)。
- 加入0.5 克阴离子交换树脂, 悬浮在其中一个液体 impingers 的 PBS 内, 另一种液体冲击器用作控制。
- 在气溶胶腔内平行放置液体 impingers, 使用夹持器, 面对喷雾器的气溶胶入口。
注: 有关其他详细信息, 请参见图 2 。 - 在液体 impingers 附近共找到一个直接读取的气溶胶监测器, 以测量气溶胶的质量浓度 (mg/米3)。
- 在液体 impingers 附近共同定位其他直接读仪器 (室内空气质量监测和热风速计), 以监测气溶胶室内的环境变量, 如温度、相对湿度和风速。
- 在气溶胶室的拐角处运行轴流风机, 以方便气溶胶的混合。
注: 轴流风机以固定速度运行, 不可调节。
2. 模型 Bioaerosolization 实验 (见图 3)
- 对磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 进行连续、10倍稀释的 MS2 噬菌体和流感疫苗的浓度。
注: 在这里演示的方法, 103.5 FFU/毫升的 a 型流感病毒疫苗菌株和 105 PFU/毫升的 MS2 噬菌体使用。为了确定菌的效价, 噬菌体被传播到大肠杆菌HS (pFamp) R, 并列举如前所述的20。该商业疫苗含有已知数量的四只活减毒菌株, 两种流感病毒和两种 B 型流感病毒, 以荧光聚焦单位或 FFU 表示。 - 在6射流碰撞雾化器的玻璃容器内制备菌, 在100毫升的 PBS 中创建所需的病毒粒子浓度悬浮液, 并在自定义气溶胶腔内安装。
- 启动仪器测量气溶胶腔内的变量, 如温度、相对湿度、二氧化碳浓度和风速 (使用轴流风机产生)。使用直接读取的气溶胶监测仪跟踪气溶胶室内的质量浓度, 并在试验之间建立一致性。
- 密封气溶胶室, 用高效过滤空气净化10分钟。
- 将经过过滤的干燥空气输送到6.9 帕的雾化器上。
- 在每个气溶胶室试验中产生病毒 bioaerosols (通过雾化器) 的靶浓度。在此演示中, 将生成浓度为5毫克/米3的 bioaerosols。
- 一旦达到目标质量浓度的气溶胶, 停止雾化。
- 对每一个已校准为12.5 升/分流量的液体冲击器操作一个空气取样泵. 在每次取样事件前后使用主流量标准进行校准, 以确保采样量的一致性。使用位于雾化器附近的高效过滤线提供稀释空气, 并在燃烧室内保持恒定的压力。
- 积极取样气溶胶室大气40分钟的时间, 以达到每样样品500升的取样量。
注: 在12.5 升/分两泵平行取样40分钟, 可取样气溶胶的1000升。因此, 在实验完成后, 预计气溶胶室中的大部分空气通过一个高效过滤系统被取样并释放到环境中。这是由颗粒浓度下降的证明。后实验, 表面被净化与10% 家用漂白剂和70% 乙醇。在本示范中使用指标;然而, 如果已知的病原体在该系统中使用, 则可根据需要实施额外的生物安全措施。
3. 核酸提取和 qRT PCR 检测
-
将核酸直接从阴离子交换树脂中分离出来, 并为比较起见, 从液体 impingers 中使用的液体隔离。在这个例子中, 我们描述了一个 RNA 隔离过程, 但是类似的协议可以用于 DNA 病毒。
- 从负离子交换树脂中分离出核酸。
- 将液体冲击器的阴离子交换树脂的所有液体转移到无菌50毫升圆锥管。
- 允许树脂沉淀, 并慢慢地从负离子交换树脂中醒酒液体样品。使用1毫升吸管尖端, 以去除所有剩余的液体从阴离子交换树脂。
- 从病毒 RNA 隔离试剂盒中, 将含有载体 RNA 的560µL 病毒裂解缓冲液直接添加到阴离子交换树脂中, 在室温下进行周期性混合孵化10分钟。
- 使用1毫升吸管尖端, 转移病毒裂解物 (病毒裂解缓冲) 到一个无菌1.5 毫升圆锥管, 并进行 rna 隔离使用病毒 rna 隔离套件 (见材料表) 按照制造商的指示, 除了RNA 是洗脱在总容量60µL 洗脱的缓冲。
- 从液体 impingers 中分离出核酸。
- 吸管140µL 的液体样品成一个无菌1.5 毫升圆锥管和执行 rna 隔离使用病毒 rna 隔离套件按照制造商的指示, 除洗脱 RNA 的总容量60µL 洗脱缓冲。
注: 140 µL 是最大样本量, 可以处理与特定的病毒 RNA 隔离套件在这里使用的一个单一步骤的准备。
- 吸管140µL 的液体样品成一个无菌1.5 毫升圆锥管和执行 rna 隔离使用病毒 rna 隔离套件按照制造商的指示, 除洗脱 RNA 的总容量60µL 洗脱缓冲。
- 从负离子交换树脂中分离出核酸。
- 执行 qRT PCR 检测 MS2 和流感 A 和 B 病毒, 如前所述23,24。在这一示范中, 5 µL 核酸 eluates 用于 qRT PCR。
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Representative Results
图 1展示了基于电荷的从 bioaerosols 捕获病毒的原理, 通过将树脂加入液体基 impingers。图 2显示了自定义构建的气溶胶室的设置。图 3描述了设置 aerosolization 实验的步骤和确保质量控制的措施。图 4显示了从 bioaerosols 捕获的负电荷病毒 qRT PCR 检测的放大曲线。表 1显示了用于本研究的示例病毒的 qRT PCR 的引物和探针。
利用流感疫苗中含有的 MS2 和流感病毒作为自定义气溶胶室中的模型, 用阴离子交换树脂改性的液体 impingers 在病毒检测中允许大约3x 到9x 的改进, 具体取决于病毒, 比直接测试撞击液22。如典型的 qRT-PCR 扩增曲线 (图 4) 所示, 当使用阴离子交换树脂比直接测试撞击液时, 可以达到3.26 个周期的流感病毒的检测。考虑到在一个100% 有效的 qRT PCR, 一个 Ct 增益相当于2倍的目标浓度增加, 这一差异相当于9.58x 提高检测。
图 1: 液体撞击与阴离子交换树脂结合.每个修改后的气溶胶取样装置都将负离子交换树脂纳入其设计中。每个树脂珠是一个0.5 到1.0 毫米球体与多孔表面, 一个特点, 增加阴离子交换表面积。功能季铵盐组允许在液体介质中捕获离子, 通过对病毒进行中介捕获, 净负表面电荷, 包括 MS2 噬菌体和流感病毒, 在本协议中用作模型有机体 (尾噬菌体被画在这里作为一个例子, 捕获病毒)。核酸隔离然后直接从树脂 (使用商业上可用的试剂盒), 与样本适用于大多数分子检测策略 (qRT PCR 在这里使用)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 自定义气溶胶室示意图.a: 6-喷射式雾化器, 在6.9 帕的产生压力下提供过滤干燥的空气;B: 轴流风机, 便于均匀 bioaaerosol 混合;C: 气溶胶监测器, 以确定相对气溶胶浓度;D: 液体冲击器与树脂;E: 无树脂液体冲击器;F: 热风速仪测量风速;G: 空气质量监测仪测量其他环境变量, 包括温度、二氧化碳和相对湿度百分比;H: 有源取样泵校准为12.5 升/分;I: 气动密封手套端口, 用于在气溶胶室内定位取样设备;J: 观察窗口。这个数字是从以前的工作中重用的, 并具有发布者22的权限。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: bioaerosolization 实验的工作流.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 阴离子交换树脂提高了 qRT PCR 检测 bioaerosols 中负电荷病毒的方法.在本例中, 接种浓度为 103.5 FFU/毫升的流感病毒被雾化到自定义气溶胶室中, 直到气溶胶质量浓度达到5毫克/米3。液体 impingers 与无树脂同时参与每个样品 (500 升) 的气溶胶。从阴离子交换树脂或冲击器液中提取病毒 RNA, qRT PCR 法测定。实验重复了三次。从树脂样品中获得的核酸平均 ct 为 26.76, 而冲击器液体样品的平均 ct 检测为 30.02 (ΔCt 3.26)。这种 Ct 的差异相当于使用阴离子交换树脂检测的9.58x 改进。请单击此处查看此图的较大版本.
| 病毒 | 底漆名称 | 底漆序列 | 参考 | |
| MS2 | GI | 5 '-ATCCATTTTGGTAACGCCG-3 ' | 23 | |
| GI 探头 | 5 '-(6-家)-TAGGCATCTACGGGGACGA-(烧烤)-3 ' | |||
| GI 转速 | 5 '-TGCAATCTCACTGGGACATAT-3 ' | |||
| 前进 (46F) | 5 '-GACATCGATATGGGTGCCG-3 ' | |||
| 探头 | 5 '-(Cy5)-CACATTCACCAGGGAGACGCATGAGA-(烧烤)-3 ' | |||
| 修订版 (186R) | 5 '-CGAGACGATGCAGCCATTC-3 ' | |||
| a 型流感病毒 | 疾病预防控制中心普及型流感病毒正前方底漆 | 5 '-GAC C-3 | 24 | |
| 疾病预防控制中心普及型流感病毒反向底漆 | 5 '-AGG TGG ACA 阿克增值税 CTA-3 ' | |||
| 疾病预防控制中心全球流感病毒探针 | 5 '-(家族)-TGC AGT CCT CGC TCA GGC 动漫-(BHQ1)-3 ' | |||
| B 型流感病毒 | 全球流感 B 病毒正前方底漆 | 5 '-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3 ' | 24 | |
| 全球流感 B 病毒反向底漆 | 5 '-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3 ' | |||
| 疾病预防控制中心全球流感 B 病毒探头 | 5 '-(乔)-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-(BHQ1)-3 ' | |||
表 1: 本研究中使用的引物和探头.所有引物和探针都来自弗里德曼等201123和 Selvaraju & Selvarangan 201024。
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Discussion
本协议概述了一种使用改进的液体 impingers 对 bioaerosols 进行敏感病毒捕获的方法。该方法对 bioaerosols 中病毒载量的检测和定量进行了优化。这里所展示的具体修改包括在普通液体冲击器中加入负离子交换树脂。该方法是为简化下游样品加工而开发的, 而其他样品处理技术, 如离心、过滤和沉淀法等, 并没有提供这样的优势。核酸的提取是直接从树脂, 不需要高容量 elutions 和多样品准备步骤, 最终有助于提高检测灵敏度的方法通过减少有效的样本体积。此外, 已经表明, 固定在固体表面上的病毒粒子可能有助于提高病毒核酸的稳定性或保留病毒传染性17,25。通过减少因 reaerosolization16造成的损失, 固定化可能进一步有助于提高捕获效率。该方法可以很容易地结合下游分子分析 (qRT PCR 在这里证明)。负离子交换树脂可进行野外提取, 并运至参考实验室进行分析, 而空气取样设备则可留在取样区内进行监测。由于该程序背后的原则涉及对携带净负表面电荷的病毒进行非特异捕获, 因此该方法有望用于检测对人体健康和兽医医学具有重要意义的多种致病性病毒。正如 Michen 和 Graule26所回顾的那样, 大量对公共和动物健康十分重要的病毒有净负表面电荷, 很少有已知的例外, 例如某些轮状病毒和脊髓灰质炎病毒菌株。
该协议不直接评价环境条件对检测灵敏度的影响;然而, 当空气取样是在现场设置, 可以想象, 如相对湿度和温度等变量可能影响收集效率横跨多种类型的空气取样器12。因此, 可以根据需要修改气溶胶室内的条件, 以适应这些环境参数。采用阴离子交换树脂法有效地将多种病毒从水样中浓缩, 具有多种理化性质, 表明颗粒物、细菌和其他环境的干扰污染物预计将是最小的18。此外, 收集缓冲区可能需要对特定病毒进行优化, 就像在某些情况下显示的那样, 优化收集缓冲区可以导致更好地保留病毒稳定性27。该方法的一个主要缺点是它不能确定病毒传染性的事实。本议定书的另一个缺点是无法评估雾化和空气取样对病毒稳定性的潜在负面影响, 包括脱水、剪切和非特定吸附气溶胶室表面22。
改进后的气溶胶取样装置可以在多种环境下进行现场取样, 包括医院、学校、农业作业和其他场所。由于对现有的空气取样设备进行了修改, 预计目前对病毒进行取样 bioaerosols 的操作者很容易收养修改后的设备。该协议在这里展示了一个使用 MS2 和流感病毒的定制的气溶胶室, 这是方法开发的有用目标, 因为它们代表了非封装和封装病毒的例子, MS2 被认为是肠道病毒的替代品, 通常用于评价 impingers22,26,27,28,29。
未来的工作将涉及优化取样条件 (即空气取样速度, 收集缓冲区) 和包括其他相关病毒的测试协议。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了来自 CDC/NIOSH 高平原山间农业健康与安全中心 (5U54OH008085) 和科罗拉多生物科学发现评估补助金计划 (14 改编-16) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
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