Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen
Summary
Enterochromaffin (EG) cellen bestaan uit een kleine subset van gastro-intestinale epitheliale cellen. EG cellen zijn elektrisch prikkelbaar en vrij serotonine, nog moeilijkheden in kweken en het identificeren van de EG cellen hebben beperkte fysiologische studies. De methode die hier gepresenteerd wordt een primaire cultuur model vatbaar voor onderzoek van afzonderlijke cellen van de EG vastgesteld door electrofysiologie.
Abstract
Enterochromaffin (EG) cellen in het gastro-intestinaal epitheel (GI) vormen de grootste subpopulatie van enteroendocrine cellen. Als gespecialiseerde zintuigcellen, EG cellen zin luminal prikkels en hen omzetten in serotonine (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release gebeurtenissen. De elektrofysiologie van deze cellen is echter slecht begrepen, omdat ze moeilijk te cultuur en zijn te identificeren. De methode voorgesteld in dit papier contouren primaire EG celculturen geoptimaliseerd voor eencellige electrofysiologie. Dit protocol maakt gebruik van een verslaggever van de transgene cyaan fluorescente proteïne (GVB) om te identificeren muis EG cellen in gemengde primaire culturen, bevordering van de aanpak voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige opnames van hele cel electrofysiologie in spanning – en stroom-clamp modi.
Introduction
Het gastro-intestinaal epitheel (GI) is een diverse Gemeenschap, bestaande uit verschillende celtypes. Enteroendocrine cellen bestaan uit ongeveer 1% van alle epitheliale cellen, en enterochromaffin (EG) cellen zijn de grootste enteroendocrine cel bevolking1. Recente studies tonen aan dat enteroendocrine2 en EG3,4 cellen elektrisch prikkelbaar zijn. Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de primaire EG cel electrofysiologie. Dus, het doel van deze studie was om primaire EG celculturen geoptimaliseerd voor hele cel electrofysiologie.
Bestaande EG-cel lijnen die produceren en afscheiden van 5-HT (bijvoorbeeld QGP-1-5, BON6, KRJ-1-7) en zijn gebruikt voor het onderzoeken van de elektrofysiologie5,8 zijn meestal gegenereerd op basis van vereeuwigd neoplastische weefsels. Terwijl de informatie overgenomen van deze cellijnen waardevolle5,8 is, zijn studies van de primaire cel electrofysiologie noodzakelijk om goed te begrijpen EG celfysiologie. De elektrofysiologie van primaire cellen van de EG is vereist voor de isolatie en de cultuur van één epitheliale cellen, die heeft is beperkt door lage levensvatbaarheid van epitheliale culturen.
De methode van de cultuur gepresenteerd in deze studie is gebaseerd op transgene muizen met fluorescently geëtiketteerde EG-cellen, zoals Tph1-GVB9, gebruikt in deze studie. De methode optimaliseert gemengde primaire epitheliale culturen ontwikkeld eerder2,,10 voor eencellige electrofysiologie3. Vorige methoden gebruikt combinaties van trypsine/EDTA plus Collagenase A of EDTA en DTT voor enzymatische spijsvertering en dichtheid verlopen te specifiek isoleren en cultuur cavia11 en rat EG cellen12. Meer recentelijk, intestinale organoids werden gegenereerd en mechanisch verstoord voor elektrofysiologische opnames4. Culturen met behulp van deze methoden zijn geschikt voor serotonine loslaat van experimenten, RT-qPCR analyse en, terwijl ze kunnen worden gebruikt voor electrofysiologie, zijn afhankelijk van het succes van tijdrovende organoid generatie, dichtheid verlopen EG cellen, worden geïdentificeerd en de cellulaire vernietigende effecten van trypsine en EDTA. Daarentegen het protocol hier beschreven verbetert enzymatische en mechanische behandelingen, optimaliseert kweken voorwaarden en procedures voor de productie van één gezonde EG cellen en geschikt voor de hoge cellulaire normen die nodig zijn voor de elektrofysiologie stroomlijnt.
Deze methode zal worden nuttig voor wetenschappers die willen werken aan primaire cellen van de EG in gemengde culturen in plaats van vereeuwigd culturen en willen onderzoeken de elektrofysiologie van afzonderlijke cellen. Echter kan het blijken minder geschikt voor de studie van cel populaties moeten sorteren of op lange termijn culturen waarvoor survival afgelopen 72 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Volledig inzicht in functie van de cel EG vereist een kwalitatief hoogwaardige primaire cultuur-methode voor het genereren van cellen voor hele cel electrofysiologie. Primaire culturen van GI epitheel had van oudsher moeilijk als gevolg van lage overleven. Deze storende factor te verlichten, levert de huidige methode culturen van enkelvoud EG cellen uit kleine of grote darm die kunnen overleven voor meerdere dagen.
Wij vonden dat essentieel is voor de verbetering van de kwaliteit van culturen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Mrs. Lyndsay Busby voor administratieve bijstand en Mr. Robert Highet van Mayo Clinic Division of Engineering voor ontwerp en 3D-printen van de cultuur schotel invoegen. Dit werk werd gesteund door de NIH K08 AB (DK106456), piloot en haalbaarheid subsidie aan AB van Mayo Clinic Center voor cel signalering in de gastro-enterologie (NIH P30DK084567) en 2015 Amerikaanse Gastoenterologische vereniging Research Scholar Award (AGA RSA) AB en NIH R01 aan GF (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
Referências
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The “normal” endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
- Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
- Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
- Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
- Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
- Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
- Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
- Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, 5959-5975 (2013).
- Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
