Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

Summary

Células enterocromafins (CE) compõem um pequeno subconjunto de células epiteliais gastrointestinais. Células de CE são eletricamente excitáveis e liberam serotonina, ainda dificuldades no cultivo e identificação de células CE limitados estudos fisiológicos. O método apresentado aqui estabelece um modelo de cultura primária favorável ao exame de células únicas CE por eletrofisiologia.

Abstract

Células enterocromafins (CE) no epitélio gastrointestinal (GI) constituem a maior subpopulação de células enteroendócrina. Como células sensoriais especializadas, CE células sentem estímulos luminal e convertê-los em eventos de liberação de serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). No entanto, a eletrofisiologia destas células é mal compreendida porque eles são difíceis para cultura e identificar. O método apresentado em culturas de células de CE primário este papel contornos otimizado para eletrofisiologia única célula. Este protocolo utiliza um repórter de proteína fluorescente ciano transgénicos (PCP) para identificar células de CE rato em culturas primárias mistas, avançando a abordagem para obtenção de gravações de alta qualidade de eletrofisiologia da célula inteira em modos de grampo de tensão e de corrente.

Introduction

Epitélio gastrointestinal (GI) é uma comunidade diversificada, consistindo de vários tipos de células. Células enteroendócrina compreendem aproximadamente 1% de todas as células epiteliais e células enterocromafins (CE) são a maior população do enteroendócrina célula¹. Estudos recentes mostram que enteroendócrina² e⁴ células de^3,CE são eletricamente excitáveis. Estamos interessados em compreender a eletrofisiologia de célula primária CE. Assim, o objetivo deste estudo foi estabelecer culturas primárias de células CE otimizadas para eletrofisiologia da célula inteira.

Célula de CE existente linhas que produzem e secretam 5-HT (por exemplo, QGP-1⁵, BON⁶, KRJ-1⁷) e têm sido usadas para examinar a eletrofisiologia^5,8 normalmente geradas a partir de imortalizado tumorais. tecidos. Enquanto as informações adquiridas destas linhas de célula são valioso^5,8, estudos de eletrofisiologia da célula primária são necessários compreender corretamente a fisiologia celular de CE. A eletrofisiologia das células primárias do CE requer o isolamento e a cultura de células epiteliais única, que tem sido limitada pela baixa viabilidade das culturas epiteliais.

O método de cultura apresentado neste estudo se baseia em ratos transgénicos com células fluorescente etiquetadas do CE, como Tph1-PCP⁹, utilizado neste estudo. O método otimiza primária mista epiteliais culturas anteriormente desenvolveram^2,10 para única célula eletrofisiologia³. Métodos anteriores combinações de tripsina/EDTA além de A colagenase ou de EDTA e de TDT para digestão enzimática e costumavam especificamente isolar e cultura cobaia¹¹ e rato CE células¹²gradientes de densidade. Mais recentemente, organoids intestinais foram gerados e mecanicamente interrompidos para gravações eletrofisiológicos⁴. Culturas usando estes métodos são adequadas para serotonina liberar experimentos, análise de RT-qPCR e, enquanto eles poderiam ser usados para eletrofisiologia, são dependente do sucesso da geração de organoides demorado, gradientes de densidade para identificar células da CE e o celulares efeitos pertubadores da tripsina e EDTA. Por outro lado, o protocolo descrito aqui melhora a tratamentos mecânicos e enzimáticos, otimiza as condições de cultivo e simplifica procedimentos para produzir células única e saudáveis de CE apropriadas para os altos padrões celulares necessários para eletrofisiologia.

Este método será útil para os cientistas que querem trabalhar em células primárias de CE em culturas mistas, em vez de culturas imortalizadas e deseja investigar a eletrofisiologia das células únicas. No entanto, pode ser menos apropriado para o estudo de populações de células que necessitam de classificação ou a longo prazo as culturas que exigem sobrevivência passado 72 h.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da clínica Mayo. A parte de cultura de célula primária do presente protocolo é baseada em métodos anteriormente publicados que podem ser referenciados por mais detalhes10. Todos os procedimentos experimentais devem ser aprovados pela (IACUC), e todos os experimentos devem ser realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes. <p class="jove_tit…

Representative Results

Culturas:Primárias células epiteliais murino, feitas a partir de um modelo de Tph1-PCP transgénico anexar aos pratos após 4 horas e estão prontas para experiências fisiológicas entre 24 a 72 h. Quando as condições de cultura não tinham sido otimizadas, a cultura de pilha epithelial consistia de grandes aglomerações, flutuante restos celulares, membranas danificadas e sinal fraco do PCP nas células CE (Figura 1A</stron…

Discussion

Compreender plenamente a função de célula CE requer um método de cultura primária de alta qualidade para gerar células para eletrofisiologia da célula inteira. Culturas primárias de epitélio GI tinham sido tradicionalmente difícil devido a baixa sobrevivência. Atenuar este fator de confundimento, o presente método produz culturas de células de CE singular do intestino pequeno ou grande que são capazes de sobreviver por vários dias.

Nós achamos que encontravam-se crítico para m…

Materials

High Glucose DMEM	Sigma	D6546	Store at 4˚ C for no longer than 1 month
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	F4135	Freeze in 25 mL aliquots  and store long term at -20˚ C
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C
Penicillin/ Streptomycin	Sigma	P0781	Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A2153	Store at 4˚ C for long term storage
Collagenase XI	Sigma	C9407	Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation
Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg	Sigma	D8662	Store long term at   4˚ C
Y-27632 (Rock Inhibitor)	StemCell	72304	Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C
100x15mm culture dish	Corning (Falcon)	351029
Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-7M
10 mL serological pipette	Corning (Falcon)	357551
50 mL Conical	Corning (Falcon)	352098
15 mL Conical	Corning (Falcon)	352097
1000 mL Barrier Pipet Tips	Thermo Scientific (Art)	2079E	Keep sterile
Matrigel, Growth Factor Reduced	Corning	354230	Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating
MatTek Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Keep sterile
Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points	Fine Science Tools	SB12630M
Surgical Scissors-Sharp	Nasco	14002-14
Micro-Dissection Scissors	Nasco	SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film	Pechiney Plastic Packaging
R6101	Dow Corning
6-mL syringe with regular luer tip	Monoject
3-mL syringe with regular luer tip	Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Data acquisition system (daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
Signal conditioner	Molecular Devices	CyberAmp 320
Software	Molecular Devices	pClamp 10.6