Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires
Summary
Cellules entérochromaffines (EC) composent un petit sous-ensemble de cellules épithéliales gastro-intestinale. Cellules EC sont électriquement excitables et libérer la sérotonine, mais des difficultés dans la mise en culture et en identifiant les cellules EC ont limité des études physiologiques. La méthode présentée ici établit un modèle de culture primaire se prêtent à l’examen des cellules individuelles de EC en électrophysiologie.
Abstract
Cellules entérochromaffines (EC) dans l’épithélium de la gastro-intestinal (GI) constituent la plus grande population de cellules entéroendocrines. Comme les cellules sensorielles spécialisées, cellules EC sentiment stimuli luminales et convertissent en événements de libération de la sérotonine (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Toutefois, l’électrophysiologie de ces cellules est mal comprise parce qu’ils sont difficiles à culture et à identifier. La méthode présentée dans ce document contours primaire EC des cultures cellulaires optimisés pour l’électrophysiologie cellulaire unique. Ce protocole utilise un reporter de la protéine fluorescente cyan transgéniques (CFP) pour identifier les cellules EC souris dans des cultures primaires mixtes, faire progresser la démarche pour obtenir des enregistrements de haute qualité d’électrophysiologie de germes entiers dans les modes de bride de tension et de courant.
Introduction
L’épithélium gastro-intestinal de (GI) est une communauté diversifiée composée de plusieurs types de cellules. Cellules entéroendocrines représentent environ 1 % de toutes les cellules épithéliales et les cellules entérochromaffines (EC) sont la population des cellules entéroendocrines plus grand1. Des études récentes montrent qu’entéroendocrines2 et3,4 cellules EC sont électriquement excitables. Nous sommes intéressés par la compréhension primaire électrophysiologie cellulaire EC. Ainsi, le but de cette étude était d’établir les cultures primaires de cellules EC optimisés pour l’électrophysiologie de cellules entières.
Existant cellules EC lignes qui produisent et sécrètent la 5-HT (p. ex., QGP-15, BON6, KRJ-1,7) et ont été utilisés pour examiner l’électrophysiologie5,8 proviennent généralement des immortalisé néoplasiques tissus. Alors que l’information acquise de ces lignées cellulaires est précieux5,8, études d’électrophysiologie cellulaire primaire sont nécessaires pour bien comprendre la physiologie des cellules EC. L’électrophysiologie de cellules primaires de EC nécessite l’isolement et la culture de cellules épithéliales isolées, qui a été limitée par la faible viabilité des cultures épithéliales.
La méthode de culture présentée dans cette étude s’appuie sur des souris transgéniques avec des cellules EC fluorescent étiquetés, comme Tph1-CFP9, utilisée dans cette étude. La méthode optimise primaires mixtes épithéliales cultures développées antérieurement2,10 pour unicellulaire électrophysiologie3. Méthodes précédentes combinaisons de trypsine/EDTA plus de collagénase A ou de EDTA et de TNT servant de digestion enzymatique et des gradients de densité permettant d’isoler spécifiquement et culture cobaye11 et rat EC cellules12. Plus récemment, organoïdes intestinales ont été générés et mécaniquement perturbés pour les enregistrements électrophysiologiques4. Cultures à l’aide de ces méthodes sont bien adaptés pour libérer des expériences, analyse de la RT-qPCR sérotonine et, alors qu’ils pourraient être utilisés pour l’électrophysiologie, dépendent de la réussite de votre temps organoïde génération, gradients de densité pour identifier les cellules EC et la cellulaires effets perturbateurs de la trypsine et d’EDTA. En revanche, le protocole décrit ici améliore les traitements enzymatiques et mécaniques, optimise les conditions de culture et rationalise les procédures afin de produire des cellules EC simples et sains pour les hauts standards cellulaires nécessaires pour l’électrophysiologie.
Cette méthode sera utile pour les chercheurs qui veulent travailler sur des cellules primaires de EC dans des cultures mixtes au lieu des cultures immortalisées et souhaiter examiner l’électrophysiologie de cellules individuelles. Toutefois, il peut s’avérer moins approprié pour l’étude des populations de cellules qui ont besoin de tri ou à long terme des cultures nécessitant une survie dernière 72 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien comprendre la fonction des cellules EC requiert une méthode de culture primaire de haute qualité pour générer des cellules pour l’électrophysiologie de cellules entières. Les cultures primaires de l’épithélium de la GI ont toujours été difficiles en raison du faible taux de survie. Alléger ce facteur de confusion, la présente méthode rendements des cultures de cellules EC du singulier de l’intestin soit petite ou grande qui sont capables de survivre pendant plusieurs jours.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mme Lyndsay Busby pour l’assistance administrative et M. Robert Highet de Mayo Clinic Division d’ingénierie pour la conception et l’impression 3D de l’insert de plat de la culture. Ce travail a été soutenu par NIH K08 AB (DK106456), pilote et subvention de faisabilité à la DGA de Mayo Clinic Center pour la signalisation de cellules en gastroentérologie (NIH P30DK084567) et 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) à AB et NIH R01 à GF (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
Referências
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