A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria
Summary
Cellule enterocromaffini (EC) comprendono un piccolo sottoinsieme delle cellule epiteliali gastrointestinali. Dalle cellule EC sono elettricamente eccitabili e rilascio della serotonina, ancora difficoltà nella coltura e nell’identificazione di cellule EC hanno limitato gli studi fisiologici. Il metodo presentato qui stabilisce un modello di cultura primaria suscettibile di esame delle singole cellule EC di elettrofisiologia.
Abstract
Cellule enterocromaffini (EC) nell’epitelio gastrointestinale (GI) costituiscono la più grande sottopopolazione delle cellule enteroendocrine. Come le cellule sensoriali specializzate, cellule EC percepiscono stimoli luminal e convertono in eventi di rilascio di serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Tuttavia, l’elettrofisiologia di queste cellule è capito male perché sono difficili per cultura e per identificare. Il metodo presentato in questa carta contorni primaria CE, colture cellulari ottimizzati per elettrofisiologia singola cella. Questo protocollo utilizza un reporter transgenici ciano proteina fluorescente (CFP) per identificare le cellule di topo CE in colture miste di primarie, avanzando l’approccio per ottenere registrazioni di alta qualità di elettrofisiologia di tutta la cella in modalità di morsetto di tensione e di corrente.
Introduction
L’epitelio gastrointestinale (GI) è una comunità variegata composta da diversi tipi di cellule. Le cellule enteroendocrine costituiscono circa 1% di tutte le cellule epiteliali e cellule enterocromaffini (EC) sono il più grande popolazione di cellule enteroendocrine1. Studi recenti dimostrano che ce3,4 cellule enteroendocrine2 e sono elettricamente eccitabili. Siamo interessati a capire primario elettrofisiologia cellulare di CE. Così, lo scopo di questo studio era di stabilire colture primarie di cellule CE ottimizzati per elettrofisiologia tutta la cella.
Cella CE esistente linee che producono e secernono 5-HT (ad es., QGP-15, BON6, KRJ-17) e sono state usate per esaminare l’elettrofisiologia5,8 vengono tipicamente generate da immortalato neoplastici tessuti. Mentre le informazioni acquisite da queste linee cellulari sono prezioso5,8, studi di elettrofisiologia cellulare primaria sono necessari per comprendere correttamente la fisiologia cellulare CE. L’elettrofisiologia di cellule primarie CE richiede l’isolamento e coltura di singole cellule epiteliali, che è stato limitato dalla bassa redditività delle culture epiteliali.
Il metodo di cultura presentato in questo studio si basa sui topi transgenici con fluorescente identificati dalle cellule EC, come Tph1-CFP9, utilizzato in questo studio. Il metodo ottimizza primaria misto epiteliali colture sviluppate in precedenza2,10 per singola cella elettrofisiologia3. Metodi precedenti utilizzate combinazioni di tripsina/EDTA plus A collagenosi o EDTA e DTT per digestione enzimatica e utilizzato gradienti di densità per isolare in modo specifico e cultura-cavia11 e ratto CE cellule12. Più recentemente, organoids intestinale sono stati generati e meccanicamente interrotta per registrazioni elettrofisiologiche4. Culture, usando questi metodi sono adatte per esperimenti, analisi di RT-qPCR di rilascio di serotonina e, mentre potrebbero essere usati per elettrofisiologia, fanno affidamento sul successo della generazione organoid che richiede tempo, gradienti di densità per identificare cellule EC e la effetti cellulari e dirompenti di tripsina ed EDTA. Al contrario, il protocollo descritto qui migliora trattamenti enzimatici e meccanici, ottimizza le condizioni di coltura e semplifica le procedure per produrre cellule EC di singole e sane adatte per gli elevati standard cellulari necessari per elettrofisiologia.
Questo metodo sarà utile per gli scienziati che vogliono lavorare su cellule primarie di CE in colture miste anziché culture immortalizzate e vuole indagare l’elettrofisiologia delle singole cellule. Tuttavia, può rivelarsi meno appropriato per lo studio di popolazioni di cellule che hanno bisogno di colture di ordinamento o a lungo termine che richiedono sopravvivenza ultime 72 ore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendere appieno la funzione delle cellule CE richiede un metodo di coltura primaria di alta qualità per generare cellule per elettrofisiologia tutta la cella. Colture primarie di epitelio GI erano stata tradizionalmente difficile dovuto la bassa sopravvivenza. Alleviare questo fattore di confusione, il presente metodo produce colture di cellule EC singolare dall’intestino sia piccolo o grande che sono in grado di sopravvivere per diversi giorni.
Abbiamo trovato che erano critici per migli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la signora Lyndsay Busby per l’assistenza amministrativa e Mr. Robert Highet Mayo il clinica divisione di ingegneria per la progettazione e la stampa 3D dell’inserto piatto cultura. Questo lavoro è stato supportato da NIH K08 AB (DK106456), pilota e fattibilità Grant a AB da Mayo Clinic Center per la segnalazione delle cellule in gastroenterologia (NIH P30DK084567) e 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) AB e NIH R01 GF (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
Referências
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