Enterochromaffin (EC) hücreleri küçük bir alt gastrointestinal epitel hücrelerinin oluşturmaktadır. EC hücreleri elektriksel olarak heyecanlı ve kültür ve EC hücreleri tanımlayan zorlukları fizyolojik çalışmalar sınırlı henüz serotonin, bırakın. Burada sunulan yöntem bir birincil kültür model tek EC hücrelerin incelenmesi için mükellef tarafından Elektrofizyoloji kurar.
Gastrointestinal (GI) epitel hücrelerinde Enterochromaffin (EC) en büyük subpopulation enteroendocrine hücre oluşturmaktadır. Özel duyu hücreleri olarak EC hücreleri luminal uyaranlara hissediyorum ve serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) yayın etkinliklerine dönüştürün. Ancak, onlar kültür ve tanımlamak için zor, çünkü bu hücreler Elektrofizyoloji kötü anlaşılmaktadır. Yöntemi bu kağıt özetliyor birincil EC hücre kültürleri içinde sunulan tek hücre Elektrofizyoloji için en iyi duruma getirilmiş. Bu iletişim kuralı transgenik Camgöbeği floresan protein (CFP) muhabir fare EC hücreleri tüm cep telefonu Elektrofizyoloji gerilim ve akım kelepçe modlarında yüksek kalite kayıtları elde etmek için yaklaşım ilerleyen karışık birincil kültürde tanımlamak için kullanır.
Gastrointestinal (GI) epitel hücre çeşitli oluşan farklı bir topluluktur. Enteroendocrine hücreleri, kabaca %1 tüm epitel hücresi oluşturan ve en büyük enteroendocrine hücre nüfus1enterochromaffin (EC) hücrelerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda enteroendocrine2 ve EC3,4 hücreleri elektriksel olarak heyecanlı olduğunu göstermektedir. Biz birincil EC hücre Elektrofizyoloji anlamakta ilgilendi. Böylece, bu çalışmada tüm cep telefonu Elektrofizyoloji için en iyi duruma getirilmiş birincil EC hücre kültürleri kurmak oldu.
Varolan EC hücre üretmek ve 5-HT (Örneğin, QGP-15, BON6, KRJ-17) salgılar ve Elektrofizyoloji5,8 incelemek için kullanılan satır genellikle oluşturulur neoplastik ölümsüzleştirilmiş doku. Bu hücre satırlarından alınan bilgi değerli5,8olsa da, birincil hücre Elektrofizyoloji çalışmaların düzgün EC Hücre fizyolojisi anlamak gereklidir. Elektrofizyoloji birincil EC hücre izolasyon ve epitel kültürler düşük canlılık tarafından sınırlandırılan kültür tek epitel hücrelerinin gerektirir.
Bu çalışmada sunulan kültür yöntemi transgenik fareler gibi Tph1-CFP9Bu çalışmada kullanılan, fluorescently etiketli EC hücrelerle kullanır. Karışık birincil yöntem optimize epitel kültürler geliştirilen daha önce tek hücre Elektrofizyoloji3için2,10 . Önceki yöntemler tripsin/EDTA artı Collagenase A veya EDTA ve DTT kombinasyonları enzimatik sindirim için kullanılan ve özellikle yalıtmak ve kobay11 ve sıçan EC hücreler12kültür için yoğunluk gradyanlar kullanılır. Daha yakın zamanlarda, bağırsak organoids oluşturulan ve mekanik elektrofizyolojik kayıtlar4için bozdu. Bu yöntemleri kullanarak kültürler serotonin yayın deneyler, RT-qPCR analiz ve Elektrofizyoloji için kullanılabilir zaman alıcı organoid üretimi, EC hücreleri tanımlamak için yoğunluk gradyanlar başarısı üzerinde ne bağlı iken için uygundur ve Tripsin ve EDTA hücresel yıkıcı etkileri. Buna karşılık, burada açıklanan protokol enzimatik ve mekanik bakımları geliştirir, kodlamayla koşulları en iyi duruma getirir ve tek ve sağlıklı EC hücreleri Elektrofizyoloji için gerekli yüksek hücresel standartlara uygun üretmek için yordamlar verimlilik düzeyini artırmak.
Bu yöntem birincil EC hücrelerde ölümsüzleştirdi kültürler yerine karma kültürler üzerinde çalışmak istediğiniz ve Elektrofizyoloji tek hücre araştırmak isteyen bilim adamları için faydalı olacaktır. Ancak, hayatta kalma Son 72 h gerektiren sıralama veya uzun vadeli kültürler gerekir hücre popülasyonlarının çalışmak için daha az uygun kanıtlayabilir.
EC hücre işlevi tam olarak anlamak için tüm cep telefonu Elektrofizyoloji hücreler üretmek için yüksek kaliteli birincil kültür yöntemi gerektirir. Birincil GI epitel kültürleri geleneksel nedeniyle düşük yaşam zor olmuştu. Bu karıştırıcı faktör hafifletilmesi, mevcut Yöntem üzerinden birkaç gün için kalan yeteneğine ya küçük ya da büyük bağırsak tekil EC hücre kültürleri verir.
Biz aşağıdaki Elektrofizyoloji için uygun olduğu kültürler kalitesini…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Bayan Lyndsay Busby yönetim yardım için ve Bay Robert Highet gelen Mayo Kliniği bölümü mühendislik tasarım ve 3D baskı kültür çanak ekleme için teşekkür ederiz. Bu eser NIH K08 AB (DK106456), Pilot ve Mayo Kliniği merkezi AB için fizibilite hibe hücre sinyallemesi Gastroenteroloji (NIH P30DK084567) ve 2015 Amerikan Gastroenterological Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (AGA RSA) için AB ve NIH için desteklenen bir durumdu R01 GF (DK52766) için.
High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
R6101 | Dow Corning | ||
6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
Electrophysiology Equipment | |||
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |