Summary

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Published: September 26, 2018
doi:

Summary

Enterochromaffin (EC) hücreleri küçük bir alt gastrointestinal epitel hücrelerinin oluşturmaktadır. EC hücreleri elektriksel olarak heyecanlı ve kültür ve EC hücreleri tanımlayan zorlukları fizyolojik çalışmalar sınırlı henüz serotonin, bırakın. Burada sunulan yöntem bir birincil kültür model tek EC hücrelerin incelenmesi için mükellef tarafından Elektrofizyoloji kurar.

Abstract

Gastrointestinal (GI) epitel hücrelerinde Enterochromaffin (EC) en büyük subpopulation enteroendocrine hücre oluşturmaktadır. Özel duyu hücreleri olarak EC hücreleri luminal uyaranlara hissediyorum ve serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) yayın etkinliklerine dönüştürün. Ancak, onlar kültür ve tanımlamak için zor, çünkü bu hücreler Elektrofizyoloji kötü anlaşılmaktadır. Yöntemi bu kağıt özetliyor birincil EC hücre kültürleri içinde sunulan tek hücre Elektrofizyoloji için en iyi duruma getirilmiş. Bu iletişim kuralı transgenik Camgöbeği floresan protein (CFP) muhabir fare EC hücreleri tüm cep telefonu Elektrofizyoloji gerilim ve akım kelepçe modlarında yüksek kalite kayıtları elde etmek için yaklaşım ilerleyen karışık birincil kültürde tanımlamak için kullanır.

Introduction

Gastrointestinal (GI) epitel hücre çeşitli oluşan farklı bir topluluktur. Enteroendocrine hücreleri, kabaca %1 tüm epitel hücresi oluşturan ve en büyük enteroendocrine hücre nüfus1enterochromaffin (EC) hücrelerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda enteroendocrine2 ve EC3,4 hücreleri elektriksel olarak heyecanlı olduğunu göstermektedir. Biz birincil EC hücre Elektrofizyoloji anlamakta ilgilendi. Böylece, bu çalışmada tüm cep telefonu Elektrofizyoloji için en iyi duruma getirilmiş birincil EC hücre kültürleri kurmak oldu.

Varolan EC hücre üretmek ve 5-HT (Örneğin, QGP-15, BON6, KRJ-17) salgılar ve Elektrofizyoloji5,8 incelemek için kullanılan satır genellikle oluşturulur neoplastik ölümsüzleştirilmiş doku. Bu hücre satırlarından alınan bilgi değerli5,8olsa da, birincil hücre Elektrofizyoloji çalışmaların düzgün EC Hücre fizyolojisi anlamak gereklidir. Elektrofizyoloji birincil EC hücre izolasyon ve epitel kültürler düşük canlılık tarafından sınırlandırılan kültür tek epitel hücrelerinin gerektirir.

Bu çalışmada sunulan kültür yöntemi transgenik fareler gibi Tph1-CFP9Bu çalışmada kullanılan, fluorescently etiketli EC hücrelerle kullanır. Karışık birincil yöntem optimize epitel kültürler geliştirilen daha önce tek hücre Elektrofizyoloji3için2,10 . Önceki yöntemler tripsin/EDTA artı Collagenase A veya EDTA ve DTT kombinasyonları enzimatik sindirim için kullanılan ve özellikle yalıtmak ve kobay11 ve sıçan EC hücreler12kültür için yoğunluk gradyanlar kullanılır. Daha yakın zamanlarda, bağırsak organoids oluşturulan ve mekanik elektrofizyolojik kayıtlar4için bozdu. Bu yöntemleri kullanarak kültürler serotonin yayın deneyler, RT-qPCR analiz ve Elektrofizyoloji için kullanılabilir zaman alıcı organoid üretimi, EC hücreleri tanımlamak için yoğunluk gradyanlar başarısı üzerinde ne bağlı iken için uygundur ve Tripsin ve EDTA hücresel yıkıcı etkileri. Buna karşılık, burada açıklanan protokol enzimatik ve mekanik bakımları geliştirir, kodlamayla koşulları en iyi duruma getirir ve tek ve sağlıklı EC hücreleri Elektrofizyoloji için gerekli yüksek hücresel standartlara uygun üretmek için yordamlar verimlilik düzeyini artırmak.

Bu yöntem birincil EC hücrelerde ölümsüzleştirdi kültürler yerine karma kültürler üzerinde çalışmak istediğiniz ve Elektrofizyoloji tek hücre araştırmak isteyen bilim adamları için faydalı olacaktır. Ancak, hayatta kalma Son 72 h gerektiren sıralama veya uzun vadeli kültürler gerekir hücre popülasyonlarının çalışmak için daha az uygun kanıtlayabilir.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Mayo Clinic tarafından onaylanmıştır. Bu protokolü birincil hücre kültür bölümüne başvurulabilir daha önce yayımlanmış yöntemleriyle ilgili daha fazla ayrıntı10temel alır. Tüm deneysel yordamlar (IACUC) tarafından onaylanmış olması gerekir ve tüm deneylerin ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. 1. kültür hazırlama …

Representative Results

Kültürler:Birincil fare epitelyal hücreler bir transgenik Tph1-CFP modelinden yapılan yemekleri 4 saat sonra takın ve 24-72 saat arasında fizyolojik deneyler için hazır. Ne zaman kültür koşulları optimize edilmemiş, epitel hücre kültürü büyük kümeleri, hücresel enkaz, hasarlı membranlar ve EC hücrelerdeki (Şekil 1A) CFP sinyali zayıf yüzen oluşuyordu. Elektrofizyoloji için optimize edilmiş kü…

Discussion

EC hücre işlevi tam olarak anlamak için tüm cep telefonu Elektrofizyoloji hücreler üretmek için yüksek kaliteli birincil kültür yöntemi gerektirir. Birincil GI epitel kültürleri geleneksel nedeniyle düşük yaşam zor olmuştu. Bu karıştırıcı faktör hafifletilmesi, mevcut Yöntem üzerinden birkaç gün için kalan yeteneğine ya küçük ya da büyük bağırsak tekil EC hücre kültürleri verir.

Biz aşağıdaki Elektrofizyoloji için uygun olduğu kültürler kalitesini…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Bayan Lyndsay Busby yönetim yardım için ve Bay Robert Highet gelen Mayo Kliniği bölümü mühendislik tasarım ve 3D baskı kültür çanak ekleme için teşekkür ederiz. Bu eser NIH K08 AB (DK106456), Pilot ve Mayo Kliniği merkezi AB için fizibilite hibe hücre sinyallemesi Gastroenteroloji (NIH P30DK084567) ve 2015 Amerikan Gastroenterological Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (AGA RSA) için AB ve NIH için desteklenen bir durumdu R01 GF (DK52766) için.

Materials

High Glucose DMEM Sigma D6546 Store at 4˚ C for no longer than 1 month
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Sigma F4135 Freeze in 25 mL aliquots  and store long term at -20˚ C
L-Glutamine Life Technologies 25030-081 Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C
Penicillin/ Streptomycin Sigma P0781 Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A2153 Store at 4˚ C for long term storage
Collagenase XI Sigma C9407 Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation
Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg Sigma D8662 Store long term at   4˚ C
Y-27632 (Rock Inhibitor) StemCell 72304 Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C
100x15mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 354230 Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6-mL syringe with regular luer tip Monoject
3-mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

Referências

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The “normal” endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
  11. Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, 5959-5975 (2013).
  12. Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
check_url/pt/58112?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

View Video