العلاج المستهدفة وانتقائية من Teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية Pluripotent استخدام الإشعاع الخارجي شعاع في نموذج الحيوانات الصغيرة
Summary
البحث عن استراتيجيات العلاج teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent مهم للترجمة السريرية للعلاج بالخلايا الجذعية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول أولاً، تولد teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية في الفئران، ومن ثم، إلى الهدف بشكل انتقائي وعلاج هذه الأورام المجراة الحيوانات الصغيرة إيرادياتور باستخدام.
Abstract
تزايد عدد ضحايا “الخلايا الجذعية السياحة،” زرع الأعضاء غير المنظم للخلايا الجذعية في العالم، أثارت مخاوف حول سلامة زرع الخلايا الجذعية. وبالرغم من أن زرع الأعضاء المتباينة بدلاً من خلايا غير متمايزة ممارسة شائعة، teratomas يمكن لا تزال تنشأ من وجود بقايا الخلايا الجذعية غير متمايزة في وقت زرع أو من الطفرات العفوية في التمييز بين الخلايا. لأنه غالباً ما يتم تسليمها علاجات الخلايا الجذعية في المواقع الحساسة تشريحيا، الأورام الصغيرة حتى يمكن أن يكون مدمراً سريرياً، أدى إلى العمى والشلل والتشوهات المعرفية، والخلل في القلب والأوعية الدموية. قد تكون العمليات الجراحية من الوصول إلى هذه المواقع أيضا محدودة، وترك المرضى مع عدد قليل من الخيارات العلاجية. السيطرة على الخلايا الجذعية سوء السلوك ولذا، حاسمة بالنسبة للترجمة السريرية للعلاج بالخلايا الجذعية.
الإشعاع شعاع خارجي يوفر وسيلة فعالة لإيصال العلاج المستهدفة لخفض عبء تيراتوما مع التقليل من الإصابة إلى المحيطة بالأجهزة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتجنب التلاعب بالجينات أو توصيل فيروسي للخلايا الجذعية، التي ترتبط بسلامة سريرية إضافية وفعالية الشواغل. هنا، نحن وصف بروتوكول إنشاء pluripotent teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية في الفئران وتطبيق العلاج الإشعاعي الخارجي شعاع ليجتذ هذه الأورام في المجراة بشكل انتقائي.
Introduction
تطوير علاجات الخلايا الجذعية لتجديد الأنسجة واجه عددا من الحواجز في العقود العديدة الماضية، تعرقل الجهود المبذولة من أجل نشر الكفاءة السريرية. وتشمل هذه العقبات استبقاء خلية الفقراء في مواقع التسليم، الاستمناع الخلايا الجذعية، وإمكانات الورمية بشكل تيراتوماس1. توموريجينيسيتي مصدر قلق خاص السريرية كما أنها قد تكون ضارة لمتلقي زرع الخلايا الجذعية2. وأبلغ حسابات لتشكيل الورم بسبب حقن الخلايا الجذعية غير المنظم فعلا في عدة إعدادات السريرية3،،من45. إمكانية تشكيل تيراتوما هو الأكثر كثيرا ما استشهد القلق السريرية في pluripotent الخلايا الجذعية (PSC) التنمية وقد أدى إلى تأخيرات وإلغاءات متعددة الخلايا الجذعية الجنينية من رفيعة (ESC) والناجم عن الخلايا الجذعية pluripotent (اللجنة التوجيهية) المحاكمات6،7،،من89. ومن ثم، هناك حاجة ملحة لإجراء تحقيقات متعدية كرس نحو توفير العلاج المناسب، ينبغي أن تنشأ هذه الأورام علاجية المنشأ.
وحتى الآن، ركزت معظم استراتيجيات السيطرة على سوء سلوك الخلايا الجذعية على تخفيض عدد PSCs مع الورمية المحتملة2،10. للأسف، سوى عدد قليل من الخلايا المتبقية (.على سبيل المثال، 1 × 104 إلى 1 × 105 خلايا11) مطلوب من أجل تشكيل تيراتوما، الذي هو الآن أقل من حد الكشف قوله فحوصات المتاحة حاليا12، 13-تتضمن المحددات الأخرى لاستخدام هذه الأساليب بريسيباريشن انخفاض الكفاءة وارتفاع المصروفات، والاعتماد على تعليق خلية واحدة قد لا تكون مناسبة لأحدث نهج هندسة الأنسجة، والأضرار المحتملة للخلية البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت.
وتناولت دراسات قليلة خيارات العلاج عقب تشكيل تيراتوما. ربما هي استراتيجية مدروسة أكثر إدماج الجينات “انتحارية” في الخلايا الجذعية البالغة14،15. يتضمن هذا الأسلوب التلاعب وراثيا أن الخلايا الجذعية لإدراج جينات المبرمج-تفعيل إيندوسيبلي التي يمكن تفعيلها من خلال التحفيز الدوائي بوستينجيكشن، وبالتالي توفير نهج إنقاذ إذا حقن الخلايا تنتج تيراتوماس. إلا أن هذا النهج، تعاني من عيوب كبيرة، بما في ذلك الآثار خارج الهدف من التعديلات الوراثية لشركات الأمن الخاصة وإمكانات تنمية تدريجية ل مقاومة المخدرات16. ويستخدم نهج مماثل الجزيئات الصغيرة للحث على موت الخلايا الانتقائي الأمنية الخاصة عن طريق تثبيط مسارات مكافحة–أبوبتوتيك17. واستهدفت الجماعات الأخرى موت الخلية الأمنية الخاصة باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات السطح بلوريبوتينسي، مثل بودوكاليكسين مثل البروتين-1 (بودكسل)18. يقف توقيت إنجاز جزيء صغير أو جسم أن يكون لها تأثير كبير على إمكانات PSCs العلاجية إذا سلمت في وقت مبكر جداً، وقد تفتقر إلى الفعالية العلاجية إذا سلمت في وقت متأخر جداً. وبالإضافة إلى ذلك، لم تدرس التأثيرات المنتظمة للجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة المستخدمة في هذا الشكل.
وثمة نهج بديل لعلاج هذه الأورام يعتمد على استخدام العلاج بالإشعاع الخارجي شعاع (إبرت). إبرت إحدى الطرائق الرئيسية المستخدمة حاليا في علاج الأورام الصلبة19. وقد مكنت الابتكارات في إبرت، بما في ذلك تطوير شعاع بروتون والشعاعية المناظير باستخدام الأشعة، استهداف تعزيز هياكل المرضية مع تجنب الأضرار بأنسجة طبيعية، مما يجعل مثالية لمعالجة تيراتوما إبرت الامتثالي تشكيل هياكل تشريحيا الحساسة20. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتجنب التلاعب بالجينات أو توصيل فيروسي للخلايا الجذعية، والذي على حد سواء محفوفة بالسلامة سريرية إضافية وفعالية الشواغل15. وأخيراً، قد مكنت السلف في الدقيقة-إيرادياتورس تطبيق إبرت في القوارض21.
في هذه المقالة، نحن لشرح كيفية إنشاء نموذج الحيوانات الصغيرة لتشكيل تيراتوما بالحقن إيبسكس البشرية في الفئران. ثم نعرض كيفية تطبيق إبرت لاستئصال هذه الأورام في المجراة مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة بطريقة انتقائية. هذا النهج يوفر علاج مستهدفة ل teratomas المستمدة من PSC مع تجنب آثار خارج الهدف إيصال النظمية للجزيئات البيولوجية والببتيدات والتحوير الوراثي شركات الأمن الخاصة. لأغراض الفحص، نحن نقدم خطوة اختيارية ترانسدوسي الخلايا الجذعية مع الجينات مراسل لتعقب استجابة الورم للعلاج بالإشعاع عبر الإضاءة الحيوية التصوير (BLI).
Protocol
Representative Results
Discussion
البيانات الإكلينيكية والحالات النادرة من ضحايا “الخلايا الجذعية السياحة” تؤكد أن خطر الإصابة تيراتوماس عيب خطير المقترنة PSC علاجات23. وضع نهج دقيق لمنع وعلاج الأورام المخاطر المرتبطة بالخلايا الجذعية العلاج ولذا، خطوة هامة في تيسير الترجمة السريرية للعلاج الخلايا الجذعية ال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر الوطنية معاهد للصحة R01 HL134830 (المعر) و K08 HL135343 (KS) 5F32HL134221 (جور)؛ معهد هوارد هيوز الطبي (ASL)؛ وفي “جامعة ستانفورد” القلب والأوعية الدموية المعهد (ASL) لدعمهم.
Materials
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
Referências
- Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).
- Kuriyan, A. E., et al. Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous "Stem Cells" for AMD. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).
- Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook. , (2012).
- Scott, C. T., Magnus, D. Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial. STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).
- Strauss, S. Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive. Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).
- Coghlan, A. Unexpected mutations put stem cell trial on hold. New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).
- Tang, C., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).
- Lee, A. S., et al. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).
- Tano, K., et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).
- Kuroda, T., et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).
- Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e284 (2016).
- Smith, A. J., et al. Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk. STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).
- Choo, A. B., et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).
- Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. Patient safety in external beam radiation therapy. American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).
- Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
- Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).
- Lee, A. S., et al. Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas. Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).
- Swijnenburg, R. J., et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).
- Cao, F., et al. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation. Pesquisa do Câncer. 69 (7), 2709-2713 (2009).
- Priddle, H., et al. Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models. Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).
- Dale, R. G. Dose-rate effects in targeted radiotherapy. Physics in Medicine & Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).
