טיפול ממוקד, סלקטיבי של Teratomas נגזר תאי גזע Pluripotent באמצעות קרינה חיצוני קרן במודל של חיית-קטן
Summary
מחקר על אסטרטגיות טיפול teratomas נגזר תאי גזע pluripotent חשוב התרגום קלינית של טיפול בתאי גזע. כאן, אנו מתארים לפרוטוקול, ראשית, להפיק תאי גזע-derived teratomas בעכברים ולאחר, מכן, ל סלקטיבי היעד ולטפל ויוו שימוש בעוצמה קטנה-חיה של גידולים אלה.
Abstract
המספר הגדל והולך של קורבנות של “תאי גזע תיירות,” השתלת ללא פיקוח של תאי גזע ברחבי העולם, העלה חששות לגבי הבטיחות של השתלת תא גזע. למרות השתלת של הבדיל ולא התאים מובחן הוא מנהג נפוץ, teratomas יכול עדיין לנבוע הנוכחות של תאי גזע מובחן שיורית בזמנו של השתלה או של מוטציות ספונטניות הבדיל תאים. כי תאי הגזע טיפולים מועברות לעיתים קרובות לאתרים רגישים מבחינה אנטומית, גידולים קטנים אפילו יכולה להיות הרסנית קלינית, וכתוצאה מכך עיוורון, שיתוק, הפרעות קוגניטיביות, בתפקוד הלב וכלי הדם. גישה כירורגית באתרים אלה עשוי גם להיות מוגבל, עוזב חולים עם כמה אפשרויות טיפוליות. שליטה תאי גזע התנהגות בלתי הולמת, לפיכך, הוא קריטי עבור התרגום קלינית של טיפול בתאי גזע.
קרינה חיצוני קרן מציע אמצעי יעיל של העברת טיפול ממוקד כדי להקטין את הנטל טרטומה תוך מזעור הפגיעה סביב האיברים. בנוסף, שיטה זו מונע מניפולציה גנטית או ויראלי התמרה חושית של תאי גזע-אשר משויכים חששות יעילות ובטיחות קליניים נוספים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליצירת teratomas נגזר תאי גזע pluripotent בעכברים וכדי להחיל חיצוני קרן הקרנות באופן סלקטיבי ablate ויוו גידולים אלה.
Introduction
ההתפתחות של תאי גזע טיפולים התחדשות רקמות נתקל מספר מחסומים בעשרות השנים האחרונות, פוגעות המאמצים לפריסה קליניים יעיל. משוכות אלה כוללים שמירה תא המסכן באתרים של משלוח, תאי הגזע immunogenicity פוטנציאל אמצעים teratomas טופס1. Tumorigenicity הוא של דאגה קלינית מסוימת כמו זה עלולים להזיק לתאי גזע להשתלות נמענים2. חשבונות היווצרות גידול עקב הזרקת תאי גזע ללא פיקוח כבר דווחו מספר הגדרות קליניים3,4,5. פוטנציאל היווצרות טרטומה הוא ביותר לעתים קרובות ציטט את הדאגה קליניים בהתפתחות תאי גזע (PSC) pluripotent יש הביא עיכובים וביטולים של מספר בעלי פרופיל גבוה בתאי גזע עובריים (ESC) וכן המושרה תא גזע pluripotent (iPSC) ניסויים6,7,8,9. לפיכך, יש צורך דחוף חקירה translational ייעודי לקראת מתן טיפול מתאים, צריך להיווצר גידולים iatrogenic אלה.
נכון להיום, רוב אסטרטגיות כדי לשלוט התנהגות בלתי הולמת תאי גזע התמקדו הפחתת מספר מגירסה tumorigenic פוטנציאליים2,10. למרבה הצער, רק מספר קטן של תאים שיורית (למשל., עונה 1 פרק 104 -עונה 1 פרק 105 תאים11) דרוש עבור טרטומה המרמזת, רחוק מתחת לגבול זיהוי צוטט על ידי מבחני זמין כעת12, 13. מגבלות אחרות של באמצעות שיטות preseparation אלה כוללים יעילות נמוכה, הוצאות גבוהות, הסתמכות על המתלים מתא בודד יכול להיות לא מתאימות גישות הנדסת רקמות חדשות יותר, ירידת ערך פוטנציאלית של התא הישרדות, engraftment.
מחקרים מעטים עסקו אפשרויות טיפול בעקבות היווצרות טרטומה. אולי האסטרטגיה ביותר למד היטב הוא שילוב של “התאבדות” גנים לתוך תאי גזע14,15. שיטה זו כרוכה מניפולציה גנטית תאי גזע לשלב של ג’ין inducible אפופטוזיס-הפעלת כי יכול להיות מופעל על ידי גירוי תרופתי postinjection, ובכך מספק גישה הצלה אם מוזרק מפרישים teratomas. גישה זו, עם זאת, סובל חסרונות משמעותיים, כולל את המטרה השפעות שינויים גנטיים של מגירסה ואת הפוטנציאל התפתחות הדרגתית של ההתנגדות סמים16. בגישה דומה מנצל מולקולות קטנות כדי לגרום מוות תאי סלקטיבי של מגירסה דרך עיכוב של מסלולים אנטי-מוות17. קבוצות אחרות בוחר תא מות מגירסה באמצעות נוגדנים נגד סמני פני השטח pluripotency, כגון podocalyxin, כמו חלבון-1 (PODXL)18. העיתוי של מולקולה קטנה או נוגדן משלוח עומד יש השפעה משמעותית על הפוטנציאל הטיפולי מגירסה אם נמסר מוקדם מדי, אולי חוסר יעילות טיפולית אם נמסר מאוחר מדי. בנוסף, ההשפעות מערכתית של מולקולות קטנות, נוגדנים להשתמש בצורה הזאת לא נחקרו.
גישה אלטרנטיבית לטיפול גידולים אלה מסתמך על באמצעות טיפול קרינתי חיצוני קרן (EBRT). EBRT הוא אחד שהאפנות העיקריים מועסקים כיום הטיפול של גידולים מוצקים19. חידושים EBRT, כולל הפיתוח של קרן פרוטונים ו סטיאוטטי radiosurgery, אפשרו מיקוד משופרת של מבנים פתולוגי תוך הימנעות נזק הרקמות, שהופך EBRT קונפורמית אידיאלי עבור מיעון תפלצת היווצרות מבנים רגישים מבחינה אנטומית20. בנוסף, שיטה זו מונע את מניפולציה גנטית או ויראלי התמרה חושית של תאי גזע, אשר הם שניהם כרוך בטיחות קלינית נוספת, היעילות נוגע15. לבסוף, ההתקדמות מיקרו-irradiators הפעלת היישום של EBRT מכרסמים21.
במאמר זה נדגים כיצד ליצור מודל קטן-חיה היווצרות טרטומה באמצעות הזרקת iPSCs אנושי בעכברים. ואז נראה איך ליישם EBRT באופן סלקטיבי להשמיד גידולים אלה ויוו עם מינימום נזק לרקמות. גישה זו מספקת טיפול ממוקד teratomas נגזר PSC תוך הימנעות ההשפעות את המטרה של המשלוח מערכתית של מולקולות ביולוגיות, פפטידים מניפולציה גנטית של מגירסה. למטרות לניסויים קליניים, אנו מציעים שלב אופציונלי כדי מגלי תאי גזע עם הגנים כתב כדי לעקוב אחר הגידול בתגובה הקרנות באמצעות ביולומינסנציה הדמיה (בלי).
Protocol
Representative Results
Discussion
מקרים אנקדוטיים קורבנות של “תאי גזע תיירות” ונתונים פרה לאשר הסיכון לפתח teratomas הוא חיסרון רציני המשויך PSC טיפולים23. פיתוח של גישות זהיר כדי למנוע ולטפל שהסיכון אמצעים תאי טיפולים, לפיכך, הוא צעד חשוב בקידום התרגום קליני בתאי גזע משובי טיפולים. במאמר זה, אנחנו תיאר שיטה טיפולית פ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות את נבחרת מוסדות של בריאות R01 HL134830 (PKN) K08 HL135343 (קאי אס), 5F32HL134221 (JWR); המכון הרפואי הווארד יוז (ASL); את סטנפורד לב וכלי דם המכון (ASL) לתמיכה שלהם.
Materials
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
Referências
- Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).
- Kuriyan, A. E., et al. Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous "Stem Cells" for AMD. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).
- Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook. , (2012).
- Scott, C. T., Magnus, D. Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial. STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).
- Strauss, S. Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive. Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).
- Coghlan, A. Unexpected mutations put stem cell trial on hold. New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).
- Tang, C., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).
- Lee, A. S., et al. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).
- Tano, K., et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).
- Kuroda, T., et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).
- Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e284 (2016).
- Smith, A. J., et al. Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk. STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).
- Choo, A. B., et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).
- Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. Patient safety in external beam radiation therapy. American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).
- Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
- Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).
- Lee, A. S., et al. Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas. Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).
- Swijnenburg, R. J., et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).
- Cao, F., et al. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation. Pesquisa do Câncer. 69 (7), 2709-2713 (2009).
- Priddle, H., et al. Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models. Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).
- Dale, R. G. Dose-rate effects in targeted radiotherapy. Physics in Medicine & Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).
