Tratamento orientado e seletivo de Teratomas células-tronco derivadas de pluripotentes usando radiação de feixe externo em um modelo animal de pequeno
Summary
Pesquisa sobre estratégias de tratamento para os teratomas de células-tronco derivadas de pluripotentes é importante para a tradução clínica de terapia de células-tronco. Aqui, descrevemos um protocolo para, em primeiro lugar, gerar células-tronco derivadas os teratomas em camundongos e, depois, para seletivamente alvo e tratar estes tumores in vivo usando uma difusora de pequenos animais.
Abstract
O crescente número de vítimas do “turismo de células-tronco,” o não regulamentado transplante de células-tronco em todo o mundo, levantou preocupações sobre a segurança do transplante de células-tronco. Embora o transplante de diferenciados ao invés de células indiferenciadas é prática comum, os teratomas ainda podem decorrer da presença de células-tronco indiferenciadas residuais no momento do transplante ou de mutações espontâneas em diferenciados células. Porque muitas vezes, terapias de células-tronco são entregues em locais sensíveis anatomicamente, mesmo pequenos tumores podem ser clinicamente devastadoras, resultando em cegueira, paralisia, anormalidades cognitivas e disfunção cardiovascular. Acesso cirúrgico a esses sites também pode ser limitado, deixando os pacientes com poucas opções terapêuticas. Controlar o mau comportamento de células-tronco é, portanto, fundamental para a tradução clínica de terapia de células-tronco.
Radiação de feixe externo oferece um meio eficaz de fornecer terapia-alvo para diminuir a carga de teratoma, minimizando lesões ao redor de órgãos. Além disso, este método evita a manipulação genética ou transdução viral de células-tronco, que estão associados com preocupações de eficácia e segurança clínica adicional. Aqui, descrevemos um protocolo para criar os teratomas de células-tronco derivadas de pluripotentes em camundongos e aplicar radioterapia de feixe externo para ablate seletivamente estes tumores in vivo.
Introduction
O desenvolvimento de terapias de células-tronco para regeneração de tecidos encontrou uma série de barreiras nas últimas décadas, prejudicando os esforços para a implantação eficiente de clínica. Estes obstáculos incluem retenção de célula pobre nos locais de entrega, imunogenicidade de células-tronco e o potencial neoplásico como forma os teratomas1. Tumorigenicidade é de particular preocupação clínica, como isso pode prejudicar de destinatários de transplante de células-tronco2. Contas de formação de tumor devido às injeções de células-tronco não regulamentada já foram relatadas em vários ambientes clínicos3,4,5. O potencial para formação de teratoma é mais frequentemente citada clínica preocupação no desenvolvimento de (PSC) células-tronco pluripotentes e provocou atrasos e cancelamentos de alto perfil Múltiplo células-tronco embrionárias (ESC) e induzida por células-tronco pluripotentes (iPSC) ensaios6,7,8,9. Assim, há uma necessidade premente de uma investigação translacional dedicada para fornecer o tratamento adequado, estes tumores iatrogênicas surgirem.
Até à data, a maioria das estratégias para controlar o mau comportamento de células-tronco têm-se centrado na redução do número de EPS com2,de potencial tumorigénico10. Infelizmente, apenas um pequeno número de células residuais (ex.., 1 x 104 a 1 x 105 células11) é necessário para formação de teratoma, que é muito abaixo do limite de detecção citada por ensaios disponíveis atualmente12, 13. outras limitações de usar esses métodos recipiente incluem baixa eficiência e alta despesa, dependência de suspensões de célula única que podem não ser adequados para novas abordagens de engenharia de tecidos e o prejuízo potencial de célula sobrevivência e enxertia.
Poucos estudos abordaram-se as opções de tratamento, seguindo-se formação de teratoma. Talvez a estratégia mais bem estudada é a incorporação de genes de “suicídio” de células-tronco de14,15. Este método envolve manipular geneticamente as células-tronco para incorporar um gene de apoptose-ativando inducible que pode ser ativado por postinjection estimulação farmacológica, proporcionando uma abordagem de resgate, se as células injetadas produzem os teratomas. Esta abordagem, no entanto, sofre de desvantagens significativas, incluindo efeitos fora do alvo de modificações genéticas do EPS e o potencial para um desenvolvimento gradual da resistência de droga16. Uma abordagem semelhante utiliza pequenas moléculas para induzir a morte celular seletiva das EPS através da inibição de anti-apoptotic vias17. Outros grupos têm como alvo a morte celular das EPS usando anticorpos contra pluripotência marcadores de superfície, tais como podocalyxin, como proteína-1 (PODXL)18. O timing da pequeno-molécula ou anticorpo entrega significa ter um impacto significativo sobre o potencial terapêutico das EPS se entregue muito cedo e podem não ter efeito terapêutico se entregue muito tarde. Além disso, não foram estudados os efeitos sistêmicos de pequenas moléculas e anticorpos utilizados desta forma.
Uma abordagem alternativa para o tratamento destes tumores baseia-se sobre o uso de terapia de radiação de feixe externo (RT). RT é uma das principais modalidades atualmente empregadas no tratamento de tumores sólidos19. Inovações em RT, incluindo o desenvolvimento do feixe de próton e radiocirurgia estereotáxica, permitiram a segmentação avançada de estruturas patológicas, evitando danos ao tecido normal, tornando RT conformal ideal para abordar o teratoma formação em estruturas anatomicamente sensível20. Além disso, este método evita a manipulação genética ou transdução viral de células-tronco, que são ambos repleta de clínicos adicionais de segurança e eficácia diz respeito a15. Finalmente, os avanços na micro-irradiators permitiram a aplicação da RT em roedores21.
Neste artigo, demonstramos como criar um modelo pequeno-animal de formação teratoma injetando iPSCs humano em ratos. Então mostramos como aplicar RT para seletivamente erradicar estes tumores in vivo com danos mínimos ao tecido circundante. Essa abordagem fornece uma terapia-alvo para os teratomas PSC-derivado, evitando os efeitos fora do alvo da entrega sistêmica de moléculas biológicas e peptídeos e a manipulação genética, o EPS. Para fins experimentais, oferecemos um passo opcional para transduce células-tronco com genes repórter para controlar a resposta do tumor à radioterapia através de bioluminescência (BLI) de imagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dados pré-clínicos e casos anedóticos de vítimas do “turismo de células-tronco” confirmam que o risco de desenvolver os teratomas é uma desvantagem grave associada com tratamentos de PSC23. Desenvolvimento de abordagens de cuidado para prevenir e tratar o risco neoplásico associado com terapias de células-tronco é, portanto, um passo importante para facilitar a tradução clínica de terapias regenerativas célula-tronco. Neste artigo, nós descrito um método de direcionamento terapêuti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer o nacional institutos de saúde R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) e 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); e o Instituto Cardiovascular de Stanford (ASL) pelo seu apoio.
Materials
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
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