バイオパニングから T7 バクテリオファージの量的な PCR
Summary
再現性の高い、正確で、時間効率的な定量的 PCR (qPCR) を列挙するメソッド T7 バクテリオファージを次に紹介します。プロトコルはバクテリオファージ DNA 調製法、PCR 反応の準備、qPCR サイクリング条件、qPCR データ分析明確にについて説明します。
Abstract
このプロトコルでは、ファージの選択実験を (すなわち、 「バイオパニング」) から T7 ファージを列挙する定量的 PCR (qPCR) の使用について説明します。qPCR DNA を定量化する蛍光ベースのアプローチは、ここで、それはバクテリオファージの粒子のためのプロキシとしてバクテリオファージのゲノムを定量化する適応。このプロトコルでは追加の DNA 精製することがなく高温加熱による安易なファージ DNA の調製法を説明します。メソッドには、熱処理したファージの量が少ないと qPCR 反応の量が少ないだけ必要があります。qPCR、高スループット、高速で処理し、列挙体の他のバクテリオファージのアプローチに 2-4 との比較における反応の 96 ウェル プレートからデータを取得することができる、qPCR は時間効率的です。ここでは、qPCR を使用して嚢胞性線維症のような粘液の in vitroモデルに対してバイオパニングから識別 T7 ファージを列挙します。バイオパニングの他のタイプを含む、他の実験から T7 ファージを定量化する qPCR 法を拡張できます (e.g。、バクテリオファージ スクリーニングの蛋白結合、体内を固定化) およびその他のソース (例えば、水システムまたは体液)。要約すると、このプロトコルは DNA でカプセル化されたウイルスを定量化する変更できます。
Introduction
1985 年にジョージ ・ スミスによって開発されたバクテリオファージ (ファージ) ディスプレイ技術は、ターゲットまたは細胞膜、病抗原、細胞細胞器官または特定の受容体に対するペプチドやタンパク質のリガンドを識別するために強力な高スループット方法臓器や組織で過去二十年1,2。ここでは、(通常 M13 または T7) に感染するバクテリオファージのコート蛋白質のポリペプチドや一本鎖抗体のランダムなライブラリが表示され、体外固定された蛋白質またはin vivoに対してパンから特異的なリガンドを識別できます。反復的な選択プロセスを生物学的システムは。次に、イメージングや治療エージェント疾患3,4の診断と治療をリガンドに結合できます。バイオパニングの複数のステップ中にファージを正確に列挙することが重要: 基質に結合するファージを定量化するには (1) と (2) 選択の各ラウンドでの濃縮があるかを決定するファージを定量化する (バクテリオファージ濃縮 biopanned を示しています。ターゲットのバクテリオファージが関係したため)。定量化、二重層プラクの試金のための現在のゴールド スタンダード複数課題;それは退屈な面倒なサンプル数が多いため不正確な可能性があります。したがって、当社グループは、バイオパニング5から M13 と T7 バクテリオファージの粒子を列挙する機密性の高い、再現可能な正確な時間効率的な量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) メソッドを開発しました。
qPCR、T7 と M13 ファージを正確に定量化する魅力的な実行可能な方法です。それぞれ個々 のバクテリオファージの粒子のみ (dsDNA または ssDNA) ゲノムの DNA の 1 つのコピーを含めることができます、ので 1 ファージのゲノムは 1 つのバクテリオファージの粒子; に相当バクテリオファージのゲノムの数を定量化することでファージの数を定量化することは不可能です。QPCR、蛍光レポーターの中に染料が非具体的バクテリオファージのゲノム DNA をバインドまたは具体的に配列特異プライマー PCR 増幅中と蛍光は、信号増幅の各ラウンドで増加します。蛍光信号を増幅のラウンド/サイクルしきい値に達したときは、しきい値サイクル (Ct) として示されています。標準曲線を確立する Ct 値に対する参照バクテリオファージ DNA 既知濃度のプロットします。DNA サンプルの Ct 値を持つ標準的なカーブを使用して、ファージの濃度を補間することができます。
多くの戦略を以前に開発し、広範囲バイオパニング ファージを定量化するために使用、それぞれの特定の課題があります。最も人気があり従来の方法は二重層プラクの試金です。ここでは、ホスト細菌シリアル希薄で作製したファージに感染している、固体寒天基板上メッキ、かぶせている寒天。ファージは、プラック数 (すなわち、プラーク形成単位または pfu) 寒天プレート上で列挙されます。プラクの試金は敏感が、退屈な時間のかかる、不正確で、特に多数のサンプルと高濃度5 です。また、酵素抗体法 (ELISA) は M13 と T7 ファージ粒子6,7、8を列挙に適応されています。異なる希釈率でファージがここでは、バインドされていると (すなわち、マイクロ プレート) 固体基板上捕獲、バクテリオファージ特異抗体を検出し、(例えば、酵素敏感 chromogenic 基板、フルオロ) の記者を使用して検出現在のバクテリオファージの粒子の数を決定します。サンプルの読み出し (例えば蛍光、吸光度) は、既知濃度のバクテリオファージの標準に対して未知濃度を定量化する使用できます。異なるファージを用いた Elisa が開発されているが、彼らは潜在的な制限があります。1 つのグループ 7 桁 (102-109 pfu/mL); スパン定量化の範囲で紙ベースのサンドイッチ elisa 法の開発ただし、このメソッドは、抗体コーティングの複数の手順が必要、試金8の全体の日取った。当社グループはまた M13 バクテリオファージの粒子を定量化する ELISA 法を開発したが、10 のより少なく敏感な検出範囲を持っていた6 1011 pfu/mL5。M13 を列挙する切替ランタニド蛍光プローブが開発され、定量データを取得; 20 分以内でした。ただし、この試金はダイナミック レンジの狭い 109 1012 pfu/mL9。1 つのグループは、ソリューションでは、M13 バクテリオファージの粒子を列挙する原子間力顕微鏡を使用が、これは高度な電子顕微鏡が必要ですのみ濃度10の狭い範囲の内で働いた。別の調査は、蛍光の M13 と T4 記者ファージをトラップし、蛍光の液滴の数によってファージをカウントする単分散エマルジョンを使用ただし、このアプローチはまた 10 から狭い定量化の範囲を展示2 106 pfu/mL11。液滴デジタル PCR は M13 ファージを定量化に使用されています中、は、このアプローチは伝染性および非伝染性のバクテリオファージの粒子の12の数の間で区別することができます。
当社グループは、qPCR T7 と M13 ファージに対して細胞の血液脳関門モデル 2 つの異なる蛍光レポーター色素5を使用してバイオパニングから特定の列挙方法を最近開発しました。前述の定量化方法と比較して、我々 が開発した qPCR 方法だった高スループットかつ多数サンプルを定量化する時間効率的であり DNase で伝染性および非伝染性のバクテリオファージの前処置を区別することが、バクテリオファージのサンプル。重要なは、このアプローチ再現性をもって、正確に定量化できます M13 と T7 バクテリオファージ バイオパニング サンプルから。バクテリオファージ qPCR 地区初心者研究者を導くためここで我々 は嚢胞性線維症 (CF)の in vitro粘液障壁に対してパン システインに制約があるライブラリ (CX7C) から T7 バクテリオファージの粒子を列挙する詳細な qPCR 法をについて説明します。この作品からは、バイオパニングの他の種類から、水、土壌、体液などの他のソースからのバクテリオファージの粒子を定量化する qPCR 法を拡張できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
QPCR ファージ ゲノム DNA の5を定量化する方法を開発したし、ここで述べると CF のような粘液のバリアに対して選択された T7 ファージを列挙する qPCR 法を適応。出版物の量的なリアルタイム PCR 実験 (MIQE) のガイドラインについては最低限の情報は、開発し、qPCR T7 ファージ15の列挙法を検証する合わせられました。我々 はバイオパニング実験からファージ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、PhRMA 財団研究スタート助成金によって支えられたし、国立心臓、肺、血液研究所健康のある国民の協会の受賞番号 R01HL138251 の下で付与します。
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
Referências
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