T7 भोजी की मात्रात्मक पीसीआर panning से
Summary
T7 भोजी की गणना करने के लिए एक reproducible, सटीक और समय कुशल मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) विधि यहां वर्णित है । प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से वर्णन फेज जीनोमिक डीएनए तैयारी, पीसीआर रिएक्शन तैयारी, qPCR सायक्लिंग शर्तों, और qPCR डेटा विश्लेषण ।
Abstract
यह प्रोटोकॉल मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के उपयोग को फेज चयन प्रयोगों (यानी, “” panning “) से T7 phages की गणना करने के लिए वर्णन करता है । qPCR एक प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोण डीएनए यों तो है, और यहां, यह फेज कणों के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में फेज जीनोम यों तो है अनुकूलित है । इस प्रोटोकॉल में, एक सतही फेज डीएनए तैयारी विधि अतिरिक्त डीएनए शोधन के बिना उच्च तापमान हीटिंग का उपयोग करते हुए वर्णित है । विधि केवल गर्मी का इलाज phages और qPCR प्रतिक्रिया के छोटे संस्करणों की छोटी मात्रा की जरूरत है । qPCR उच्च प्रवाह और तेजी से, प्रक्रिया और एक ९६ से डेटा प्राप्त करने में सक्षम है-प्रतिक्रियाओं का अच्छी तरह से प्लेट में 2-4 एच अंय फेज गणन दृष्टिकोण की तुलना में, qPCR अधिक समय कुशल है । यहां, qPCR T7 के खिलाफ इन विट्रो सिस्टिक फाइब्रोसिस-बलगम मॉडल की तरह panning से पहचाना phages गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । qPCR विधि अन्य प्रयोगों से T7 phages यों को बढ़ाया जा सकता है, जिसमें अन्य प्रकार की panning (जैसे, मैटीरियल प्रोटीन बाइंडिंग, विवो फेज स्क्रीनिंग में) और अन्य स्रोतों (जैसे, पानी की व्यवस्था या शरीर के तरल पदार्थ) शामिल हैं. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के लिए किसी भी डीएनए-encapsulated वायरस यों तो संशोधित किया जा सकता है ।
Introduction
भोजी (फेज) प्रदर्शन प्रौद्योगिकी, १९८५ में जॉर्ज स्मिथ द्वारा विकसित की है, एक शक्तिशाली, उच्च प्रवाह दृष्टिकोण के लक्ष्य या कोशिका झिल्ली, रोग एंटीजन, सेलुलर organelles या विशिष्ट से रिसेप्टर्स के खिलाफ पेप्टाइड या प्रोटीन लाइगैंडों की पहचान है अंगों और ऊतकों पिछले दो दशकों में1,2. यहां, polypeptides या एकल चेन एंटीबॉडी के यादृच्छिक पुस्तकालयों phages (आमतौर पर M13 या T7) के कोट प्रोटीन पर प्रदर्शित कर रहे हैं, और विशिष्ट लाइगैंडों इन विट्रो में या vivo में मैटीरियल प्रोटीन के खिलाफ panning से पहचाना जा सकता है एक चलने चयन प्रक्रिया के माध्यम से जैविक प्रणालियों । फिर, लाइगैंडों3,4रोगों के निदान और उपचार के लिए इमेजिंग या चिकित्सकीय एजेंटों के साथ युग्मित किया जा सकता है । यह सही है की गणना करने के लिए phages के कई चरणों के दौरान सटीक: (1) सब्सट्रेट करने के लिए बाइंड करने के लिए phages है और (2) phages यों तो चयन के प्रत्येक दौर के साथ संवर्धन है निर्धारित करने के लिए (फेज संवर्धन panned इंगित करता है लक्ष्य के लिए फेज अपनत्व) । ठहराव, डबल परत पट्टिका परख के लिए वर्तमान सोने के मानक, कई चुनौतियां प्रस्तुत करता है; यह थकाऊ, बोझिल है, और संभावित नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए गलत है । इसलिए, हमारे समूह ने एक संवेदनशील, reproducible, सटीक और समय कुशल मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) विधि विकसित की है M13 और T75panning से फेज कणों की गणना करने के लिए ।
qPCR एक आकर्षक और व्यवहार्य विधि को सही मात्रा T7 और M13 phages है । के बाद से प्रत्येक व्यक्ति फेज कण केवल जीनोमिक डीएनए (dsDNA या ssDNA) की एक प्रति शामिल कर सकते हैं, एक फेज जीनोम एक फेज कण के बराबर है; फेज जीनोम की संख्या को बढ़ाता द्वारा, यह phages की संख्या यों तो संभव है । qPCR के दौरान, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर रंजक फेज जीनोमिक डीएनए गैर विशेष रूप से या विशेष रूप से अनुक्रम के माध्यम से, पीसीआर प्रवर्धन के दौरान विशिष्ट प्राइमरों, और प्रतिदीप्ति संकेत वृद्धि के प्रत्येक दौर के साथ बढ़ जाती है । जब प्रतिदीप्ति संकेत दहलीज तक पहुँच जाता है, उस दौर/प्रवर्धन का चक्र दहलीज साइकिल (सीटी) के रूप में विख्यात है । संदर्भ फेज डीएनए के ज्ञात सांद्रता उनके सीटी मूल्यों के खिलाफ साजिश के लिए एक मानक वक्र स्थापित कर रहे हैं । डीएनए नमूनों की सीटी मूल्यों के साथ मानक वक्र का उपयोग करना, phages की सांद्रता दुओं जा सकता है ।
जबकि कई रणनीतियों पहले से विकसित किया गया है और बड़े पैमाने पर panning से phages यों तो इस्तेमाल किया, उनमें से प्रत्येक विशिष्ट चुनौतियों है । सबसे लोकप्रिय और पारंपरिक विधि डबल परत पट्टिका परख है । यहां, मेजबान जीवाणु सीरियल कमजोर पड़ने पर तैयार phages से संक्रमित हैं, एक ठोस आगर सब्सट्रेट पर चढ़ाया जाता है, और आगर के साथ मढ़ा जाता है; phages का गठन सजीले टुकड़े की संख्या के साथ गणना कर रहे हैं (यानी, पट्टिका बनाने इकाइयों या pfu) पर आगर प्लेट. पट्टिका परख संवेदनशील लेकिन थकाऊ, समय लेने वाली और गलत है, विशेष रूप से कई नमूनों के लिए और उच्च सांद्रता5के साथ है । इसके अतिरिक्त, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) के लिए M13 और T7 फेज6 कणों,7,8गणना अनुकूलित किया गया है । यहां, विभिंन कमजोर पड़ने पर phages और बंधे है एक ठोस सब्सट्रेट पर कब्जा कर लिया (यानी, एक microplate), फेज के साथ जांच की विशिष्ट एंटीबॉडी, और रिपोर्टर का उपयोग करके पता चला (जैसे, एंजाइम संवेदनशील chromogenic सब्सट्रेट, fluorophores) वर्तमान फेज कणों की संख्या निर्धारित करते हैं । नमूनों की readouts (जैसे, प्रतिदीप्ति, अवशोषण) ज्ञात सांद्रता में फेज मानकों के खिलाफ अज्ञात सांद्रता यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । विभिंन फेज आधारित एलिसा विकसित की गई है लेकिन वे संभावित सीमाएं हैं । एक समूह एक ठहराव रेंज है कि परिमाण के सात आदेश फैले के साथ एक कागज आधारित सैंडविच एलिसा विकसित (102-109 pfu/ हालांकि, इस विधि एंटीबॉडी कोटिंग के कई कदम की आवश्यकता है और8परख के लिए एक पूरे दिन के लिए ले लिया । हमारे समूह ने भी M13 फेज कणों यों तो एक एलिसा विधि विकसित की है लेकिन एक कम संवेदनशील 106 से 1011 pfu/ स्विच lanthanide प्रतिदीप्ति जांच M13 की गणना करने के लिए विकसित किया गया है और ठहराव डेटा 20 मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, इस परख 109 से 1012 pfu/एमएल9के एक संकीर्ण गतिशील रेंज है । एक समूह परमाणु बल माइक्रोस्कोपी समाधान में M13 फेज कणों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन इस उन्नत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता है और केवल10सांद्रता की एक संकीर्ण रेंज के भीतर काम किया. एक और अध्ययन फ्लोरोसेंट बूंदों की संख्या से फ्लोरोसेंट M13 और टी-4 रिपोर्टर phages और गिनती phages जाल monodisperse इमल्शन का इस्तेमाल किया; हालांकि, इस दृष्टिकोण भी 102 से 106 pfu/एमएल11से एक संकीर्ण ठहराव रेंज का प्रदर्शन किया । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर M13 phages यों तो इस्तेमाल किया गया है, इस दृष्टिकोण12संक्रामक और गैर संक्रामक फेज कणों की संख्या के बीच अंतर करने में असमर्थ है.
हमारे समूह ने हाल ही में qPCR तरीकों को विकसित किया है T7 और M13 phages एक रक्त मस्तिष्क बाधा सेल मॉडल के खिलाफ panning से पहचाना दो अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर5रंजक का उपयोग कर । aforementioned ठहराव तरीकों की तुलना में, qPCR तरीकों हम विकसित उच्च प्रवाह और समय के लिए कई नमूनों और DNase मैं पूर्व उपचार के साथ संक्रामक और गैर संक्रामक phages के बीच अंतर करने में सक्षम कर रहे थे कुशल फेज नमूने । महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण reproducibly और सही ढंग से panning नमूनों से M13 और T7 bacteriophages मात्रा कर सकते हैं । फेज qPCR के क्षेत्र में नौसिखिया शोधकर्ताओं गाइड करने के लिए, यहाँ हम एक विस्तृत qPCR विधि एक फेज-विवश पुस्तकालय से T7 cysteine कणों की गणना करने के लिए का वर्णन (CX7C) एक इन विट्रो सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) बलगम बाधा के खिलाफ panned. इस काम से, qPCR विधि अंय प्रकार की panning और पानी, मिट्टी, और शरीर के तरल पदार्थ सहित अंय स्रोतों से फेज कणों यों तो बढ़ाया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम विकसित qPCR तरीके फेज जीनोमिक डीएनए यों तो5, और यहां हम वर्णित है और एक qPCR विधि T7 phages एक CF-बलगम की तरह बाधा के खिलाफ चयनित गणना करने के लिए अनुकूलित । मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर प्रयोगों (MIQE) दिशानिर…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम PhRMA फाउंडेशन रिसर्च स्टार्टर अनुदान और राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों के रक्त संस्थान पुरस्कार संख्या R01HL138251 के तहत द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
Referências
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