Summary

L’acide hyaluronique basée Hydrogels pour 3-Dimensional Culture de cellules de glioblastome dérivé de Patient

Published: August 24, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la culture de cellules de glioblastome dérivé de patient dans les biomatériaux orthogonalement accordable conçu pour imiter la matrice de cerveau en trois dimensions. Cette approche fournit une in vitro, une plate-forme expérimentale qui conserve plusieurs caractéristiques de in vivo glioblastoma cellules généralement perdus dans la culture.

Abstract

Glioblastome (GBM) est le plus courant, encore plus meurtrière, le cancer du système nerveux central. Ces dernières années, de nombreuses études ont mis l’accent sur comment la matrice extracellulaire (MEC) de l’environnement de cerveau unique, comme l’acide hyaluronique (HA), facilite l’invasion et la progression de GBM. Toutefois, la plupart des modèles in vitro culture incluent les cellules GBM en dehors du contexte d’un ECM. Xénogreffes murins de cellules GBM sont utilisés couramment aussi bien. Cependant, in vivo modèles rendent difficile d’isoler les contributions des caractéristiques individuelles du microenvironnement tumoral complexe au comportement de la tumeur. Nous décrivons ici une plateforme de base d’hydrogel, en trois dimensions (3D) culture HA qui permet aux chercheurs de modifier indépendamment rigidité et concentration HA. Poids moléculaire élevé HA et polyéthylène glycol (PEG) comprennent des hydrogels, qui sont réticulés par addition de Michael-type en présence de cellules vivantes. Hydrogel 3D cultures dérivées de patient GBM cellules exposition viabilité et prolifération tarifs comme, ou mieux, lorsque cultivées en standard gliomaspheres. Le système hydrogel permet également l’incorporation des peptides ECM-mimétique d’isoler les effets des interactions cellule-ECM spécifique. Les hydrogels sont optiquement transparents afin que les cellules vivantes peuvent être photographiées sur la culture 3D. Enfin, HA hydrogel cultures sont compatibles avec les techniques habituelles pour les analyses moléculaires et cellulaires, y compris les PCR, Western Blot et cryosectioning suivie par immunofluorescence souillant.

Introduction

Systèmes en trois dimensions (3D) culture récapitulent les interactions entre les cellules et leur matrice extracellulaire environnante (ECM) dans les tissus natifs mieux que leurs deux dimensions (2D) homologues1,2. Avancées en génie tissulaire ont donné lieu à des plates-formes de culture sophistiquée, 3D qui permettent une enquête contrôlée 1) Comment chimiques et physiques des composants des comportements cellulaires de matrice microenvironnement affect et 2) l’efficacité de nouvelles thérapeutiques stratégies pour un certain nombre de maladies, y compris les cancers2. Alors que les modèles in vitro ne peuvent tenir compte des facteurs systémiques, telles que les signaux endocriniens et immunitaires et donc ne peut pas remplacer complètement les modèles in vivo , ils offrent plusieurs avantages dont la reproductibilité, contrôle expérimental, abordabilité et vitesse. Nous décrivons ici l’utilisation d’hydrogels cerveau-mimétiques dans lequel 3D des cultures de cellules de tumeur de cerveau dérivée de patient capturent beaucoup d’aspects de la physiologie de la tumeur, en particulier, la dynamique d’acquisition traitement résistance3. Par rapport aux autres méthodes in vitro , ces cultures mieux représentent in vivo les modèles de la tumeur et les observations cliniques3.

Glioblastome (GBM) est le cancer le plus fréquent et mortel originaires dans le cerveau, avec une médiane de survie de seulement 1 à 2 ans4,5. Ces dernières années, de nombreuses études ont porté sur l’influence de l’environnement matriciel tumeur dans GBM6,7,8. L’ECM de cerveau unique a été signalée à affecter la résistance thérapeutique6,7,8,9,10,11 , prolifération et la migration cellulaire GBM , 12. l’acide hyaluronique (HA) est un abondant glycosaminoglycanes (GAG) dans le cerveau, où elle interagit avec les autres GAGs et protéoglycanes pour former un hydrogel-comme maille13. De nombreuses études ont rapporté HA surexpression dans les tumeurs GBM et ses effets subséquents sur cancer progression8,9,13,14,15,16 ,,17. Autres composants ECM affectent également GBM tumeur croissance et invasion6,7,15,18. Par exemple, la fibronectine et la vitronectine, qui sont généralement surexprimés dans GBM, induisent hétérodimérisation des intégrines surface cellulaire en se liant à la séquence « RGD » et lancer des cascades de signalisation complexes qui favorisent la survie de tumeur19 ,20,21. En plus d’influences biochimiques, les propriétés physiques de la matrice de tissus affectent également GBM progression22,23.

Acquisition continuelle de la résistance aux traitements est l’un des principaux moteurs du GBM létalité4. Médicaments, montrant des résultats prometteurs dans des modèles 2D ou gliomasphere n’ont pas réussi dans les études animales et cas cliniques3, indiquant que les effets des facteurs micro-environnementales ont contribué significativement à GBM tumeur réponse1. Alors que les modèles animaux peuvent fournir un 3D, physiologiquement approprié microenvironnement aux cellules de patients initialement et générer des résultats cliniquement pertinents24,25, la complexité du cerveau microenvironnement en vivo rend difficile de déterminer quelles fonctionnalités, y compris les interactions cellule-matrice, sont des résultats biologiques clés spécifiques. Identification de nouvelles cibles thérapeutiques bénéficieront de l’utilisation des plateformes de culture simplifiée dans laquelle sont définies des propriétés biochimiques et biophysiques.

Contrairement aux modèles de biomatériau rapportées antérieurement des GBM tumeur microenvironnement26,27 qui n’ont pas atteint de vrai contrôle orthogonaux sur spécificités biochimiques et physiques de l’ECM, la plate-forme de biomatériau signalés ici permet le découplage des contributions de plusieurs fonctions indépendantes pour phénotype cellulaire GBM. Nous présentons ici un système axée sur les HA, orthogonalement accordable, hydrogel pour 3D culture de cellules dérivées de patient GBM. Hydrogels sont formés à partir de deux composants de polymère : HA 1) biologiquement actif et 2) biologiquement inerte de polyéthylèneglycol (PEG). PEG est un matériau biocompatible et hydrophile utilisé avec adsorption hypoprotidique et immunogénicité minimes28. Ici, environ 5 % des portions acide glucuronique sur les chaînes de HA sont fonctionnalisés avec des groupements thiol pour permettre la réticulation à une 4-bras-cheville commercialement disponible dernière mise à jour maleimides par l’addition de Michael-type. Dans sa forme la plus commune dans le corps, HA existe dans les chaînes de masse moléculaire élevée (HMW). Ici, un faible degré de modification de HMW HA (500-750 kDa) contribue à préserver des interactions natives de HA et ses récepteurs cellulaires, y compris CD4429. En substituant PEG-thiol pour HA-thiol tout en conservant une constante molaire des thiols totales à maléimides, HA concentration peut être dissociée de propriétés mécaniques de l’hydrogel qui en résulte. En outre, stoechiométriques contrôles peuvent être utilisés pour conjuguer la cystéine se terminant par des peptides à un nombre défini de moyens de bras se terminant par maléimide sur chaque 4-bras-cheville. Incorporation des peptides dérivés de ECM, adhésifs permet des interactions avec les intégrines sur des cellules cultivées, à travers lequel des signaux biochimiques et chimiques sont transduits1. Très vite, l’addition de la maléimide-thiol se produit dans des conditions physiologiques, en réduisant au minimum le temps requis pour l’encapsulation de cellules et de maximiser la survie des cellules dérivées de patient. Par ailleurs, cultures hydrogel peuvent être traitées comme spécimen de tissu typique et sont compatibles avec les techniques de caractérisation standard y compris Western Blot, cytométrie en flux et immunofluorescence souillant. Le protocole suivant décrit les procédures de fabrication des hydrogels, établir les cultures de cellules GBM DERIVEES du patient et de techniques d’analyse biochimique 3D.

Protocol

Tous les tissus humains collection étapes ont été effectuées en vertu de protocoles approuvés sur le plan institutionnel. 1. Thiolation d’acide hyaluronique Remarque : Rapports molaires sont précisées en ce qui concerne le nombre total de groupes carboxylate, sauf indication contraire. À 10 mg/mL dans de l’eau déionisée, distillée (DiH2O) en autoclave stérilisé, erlenmeyer de 250 mL, dissoudre 500 mg de hyaluronate de sodium (H…

Representative Results

Pour chaque lot de THIOLÉS HA, le degré de thiolation doit être vérifié à l’aide de la RMN du1H ou test d’un Ellman. HA modification selon la procédure décrite ici constamment génère environ 5 % thiolation (définie comme le rapport molaire des thiols de disaccharides HA) (Figure 1). Mise en place de cette nouvelle plateforme culture exigera de chaque labora…

Discussion

Génération de données reproductibles à l’aide de ce système de culture 3D nécessite : 1) conforme au lot thiolation de HA, 2) pratique pour atteindre efficace de mélange de précurseurs de l’hydrogel et de manipulation d’hydrogel pour éviter d’endommager les cultures et 3) optimisé ensemencement densité pour chaque lignée cellulaire utilisée.

Lorsqu’un pourcentage d’un poids particulier de HA est souhaitable dans l’hydrogel, le degré de thiolation d’HA détermine …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu financée par les NIH (R21NS093199) et prix de l’ARC de l’UCLA 3R. Nos remerciements vont au laboratoire du Dr Harley Kornblum pour la fourniture des lignées de cellules HK301 et HK157. Nous remercions également UCLA tissu pathologie Core laboratoire (TPCL) cryosectioning, laboratoire central de Advanced Light microscopie/spectroscopie (ALMS) dans California Nanosystems Institute (CNSI) à UCLA pour une utilisation de la microscopie confocale, UCLA Crump Institute for Imagerie moléculaire pour l’utilisation de système d’imagerie IVIS, UCLA moléculaire Instrumentation Center (MIC) pour prévoyant la fourniture d’instrumentation pour l’écoulement de spectroscopie par résonance magnétique et écoulement Cytometry Core dans Jonsson complets Cancer Center (CMCD) à l’UCLA cytométrie en flux.

Materials

pH meter Thermo Fisher N/A Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity
Stir plate Thermo Fisher N/A General lab equipment
Erlenmeyer flask (125mL) Thermo Fisher FB-501-125
dialysis tubes Thermo Fisher 21-152-14
2L polypropylene beaker Thermo Fisher S01916
sodium hyaluronan Lifecore HA700k-5 500-750 kDa range
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo Fisher PI-22980
N-hydroxysuccinimide (NHS) sigma aldrich 130672-5G
Hydrochloric acid (HCl) Thermo Fisher SA48-500
Sodium hydroxide (NaOH) Thermo Fisher SS266-1
Cystamine dihydrochloride Thermo Fisher AC111770250
Dithiolthreitol (DTT) Thermo Fisher BP172-25
Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid Sigma Aldrich D218200-1G
Deuterated water (deuterium oxide) Thermo Fisher AC166301000
0.22µm vacuum driven filter CellTreat 229706
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher P32080-100T
Hanks' balanced salt saline (HBSS) Thermo Fisher MT-21-022-CV
4-arm-PEG-maleimide JenKem Technology A7029-1 molecular weight around 20kDa
4-arm-PEG-thiol JenKem Technology A7039-1 molecular weight around 20kDa
L-Cysteine  sigma aldrich C7880-100G
RGD ECM mimetic peptide Genscript Biotech N/A Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated
silicone molds Sigma Aldrich GBL664201-25EA Use razor blade to cut into single pieces
complete culture medium Various Various DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs
patient derived GBM cell N/A N/A
20G needle BD medical 305175
1mL syringe Thermo Fisher 14-823-434
10mL syringe BD medical 302995
RIPA Buffer Thermo Fisher PI-89901
protease/phosphatase inhibitor mini tablet sigma aldrich 5892970001
vortex shaker Thermo Fisher 12-814-5Q
TrypLE express Thermo Fisher 12604013
70µm cell strainer Thermo Fisher 22-363-548
Paraformaldehyde Thermo Fisher AC416785000 Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4
D-sucrose Thermo Fisher BP220-1
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Thermo Fisher NC9373881
Cell culture incubator Thermo Fisher N/A Any General One with 5% CO2 and 37C
fridge/freezer Thermo Fisher N/A Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity
Disposable embedding molds Thermo Fisher 12-20
Lyapholizer Labconco N/A Any -105C freeze dryers
HEPES Thermo Fisher BP310-500
Amber vial Kimble Chase 60912D-2
Wide orifice pipette tips Thermo Fisher 9405120
2-methylbutane Thermo Fisher 03551-4
Dry Ice N/A N/A

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Citar este artigo
Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells. J. Vis. Exp. (138), e58176, doi:10.3791/58176 (2018).

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