הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי
Summary
רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג’ין הפיך.
Abstract
רגולציה של דחיסת כרומטין הוא תהליך חשוב השולט ביטוי גנים פרוקריוטים גבוה יותר. למרות דחיסת כרומטין, הכונה ביטוי נפוץ שיבשו למחלות רבות, יש שהיה חסר שיטה ספציפית לוקוס אנדוגני, הפיך ללמוד ולשלוט מנגנונים אלה של פעולה. כדי לטפל בבעיה זו, יש שפותחה ואנו מאופיין מולקולות bifunctional מווסת הגן הרומן. מרכיב אחד של המולקולה bifunctional מאגד לעוגן חלבון-דנ א. כך זה להיות מגויס של לוקוס אלל ספציפי. הרכיב השני עוסק אנדוגני הסלולר שינוי כרומטין מכונות, מגייס חלבונים אלה אל הגן עניין. אלו מולקולות קטנות, שנקרא מכפילי epigenetic כימי (CEMs), מסוגלים לשלוט ביטוי גנים וסביבה כרומטין באופן תלוי מינון והפיך. כאן, אנו מפרטים בגישה צ’ם ויישומו כדי להקטין את ביטוי גנים והיסטון acetylation זנב-עיתונאי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הממוקמת על לוקוס Oct4 של תאי גזע עובריים בעכבר (mESCs). אנו מאפיינים את ההפניה צ’ם (CEM23) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, cytometry זרימה immunoprecipitation כרומטין (צ’יפ), ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). בעוד כוחה של מערכת זו הוא הפגין-מיקומה Oct4 , מבחינה מושגית, הטכנולוגיה צ’ם מודולרית, ניתן להחיל סוגי תאים אחרים ו אחרים לוקוסים גנומית.
Introduction
כרומטין מורכב DNA סביב חלבונים octamer היסטון בצורת חלקיקים נוקלאוזום את הליבה. רגולציה של דחיסת כרומטין הוא מנגנון חיוני עבור נאות DNA תיקון, שכפול, ביטוי1,2,3. דרך אחת שבה תאים לשלוט על רמת דחיסה היא דרך הוספה או הסרה של שינויים הזנב היסטון post-translational שונים. שני שינויים אלה כוללים acetylation (1) ליזין, אשר מזוהה בדרך כלל עם הפעלת גנים, מתילציה (2) ליזין, אשר ניתן לשייך הפעלת גנים או דיכוי, בהתאם להקשר חומצת אמינו. התוספת של הסימנים acetylation, מתילציה היא מזורז על ידי היסטון acetyltransferases (כובעים) היסטון methyltransferases (HMTs), בהתאמה, ואילו הסרת הסימן נעשית על ידי היסטון deacetylases (HDACs) והיסטון demethylases (HDMs ), בהתאמה4,5. למרות קיומו של חלבונים אלה ידוע כבר עשרות שנים, מנגנונים רבים של מכונות איך שינוי כרומטין להסדיר כראוי ביטוי גנים עדיין מוגדר. מאז תהליכים רגולטוריים כרומטין dysregulated מחלות אנושיות רבות, תובנות חדשות מכניסטית עלול להוביל יישומים טיפוליים בעתיד.
כרומטין ויוו וזמינותו (CiA) היא טכניקה תיאר לאחרונה המשתמשת משרן כימי של קירבה (CIP) לשליטה שינוי כרומטין מכונות גיוס לוקוס ספציפי6. טכנולוגיה זו שימש ללמוד רשימת המתרחב של דינמיקה כרומטין, לרבות שינוי היסטון חלבונים, remodelers כרומטין שעתוק גורמים6,7,8,9. כרומטין מבוסס-CIP tethering של חלבונים exogenously ביטוי גם הוארך מעבר-CiA כדי לווסת את הלא-לאחרונה אתרים המקודדים גנטי על ידי שימוש עם שהפעלתם בוטלה מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר CRISPR-הקשורים חלבון (dCas9) 10 , 11. במערכת ה-CiA, mESCs שונו כדי לבטא גן כתב GFP-מיקומה Oct4 , אזור מאוד ביטוי ומוסדרת בקפדנות של הגנום mESC. בעבר, מערכת זו הוחל כדי לתאר את גיוס למינון והפיך הטרוכרומטין exogenously ביטוי חלבון 1 (HP1), אנזים זה נקשר H3K9me3 ומפיץ דכאניים סימני (למשל, H3K9me3) ו- DNA מתילציה6. כדי להשיג סוג זה של אסטרטגיית הגיוס, mESCs נגועים פלסמיד המבטאת של FK506 מחייב חלבון (FKBP) מקושר של Gal4, אשר עוגן DNA-חלבון הנקשרת מערך Gal4 מחייב במעלה הזרם של הכתב GFP. התאים נגועים גם עם תחום FKBP-rapamycin-איגוד (FRB) מחובר HP1. כאשר mESCs נחשפים nanomolar נמוך ריכוזי CIP, נכנסים ביחד rapamycin, הן FRB והן FKBP, על מיקומה היעד. בתוך ימים של טיפול rapamycin, ביטוי של הגן היעד מודחק, כפי שמעידים cytometry מיקרוסקופ וזרימה פלורסצנטיות, acetylation היסטון הוא ירד, המוצג על ידי שבב ורצף ביסולפאט. בזמן פיתוח, אימות של גישה זו כבר התקדמות משמעותית בתחום של מחקר כרומטין ורגולציה, חסרון אחד הוא הביטוי אקסוגני נדרש שינוי כרומטין מכונות.
כדי להפוך את הטכנולוגיה מבוסס על גיוס של רק אנזימים אנדוגניים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מערכת מודולרית יותר, אנו תוכנן, אפיינו את הרומן מולקולות bifunctional, הנקרא CEMs (איור 1)12. מרכיב אחד של CEMs כולל FK506 אשר, בדומה rapamycin, נקשר בחוזקה, במיוחד כדי FKBP. לכן, עדיין גייס את CEMs על מיקומה Oct4 ב mESCs ה-CiA. המרכיב השני של CEMs הוא moiety המאגד מכונות שינוי כרומטין אנדוגני. במחקר פיילוט, בדקנו CEMs מכילות מעכבי HDAC. בעוד הרעיון של שימוש מעכב לגייס HDACs נראה פזיזה, המדכא הוא בכל זאת מסוגל לגייס HDAC פעילות הגן עניין. מטרה זו מושגת על ידי (1) ניתוב מחדש את HDAC כדי מיקומה, שחרור האנזים, הגדלת הצפיפות של האו ם עכבות HDACs באזור, (2) שמירה על עיכוב HDAC על מיקומה, אך גיוס מתחמים דכאניים לאגד HDACs מאופק, או (3) שילוב של שניהם. במחקר הקודם, הראינו כי CEMs הצליחו להדחיק בהצלחה הכתב GFP באופן במינון ותלוי זמן, כמו גם באופן זה היה הפיך במהירות (קרי, תוך 24 שעות)12. אנחנו מאופיין ביכולת של הטכנולוגיה צ’ם המובאים כאן כדי בקרת ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, cytometry זרימה, ואת היכולת לשלוט על הסביבה כרומטין באמצעות שבב-qPCR6. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות ואפיון של CEMs, אשר יקל את העיבוד של מערכת זו כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לביולוגיה כרומטין.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנחנו תיאר מערכת צ’ם שפותחו לאחרונה מיושמת להסדיר ביטוי גנים וסביבה כרומטין-גן ספציפי באופן תלוי מינון. אנו מספקים שיטה מדויקת כדי ללמוד את הדינמיקה מעורב בוויסות ביטוי גנים דרך גיוס סלקטיבית של חלבוני כרומטין אנדוגני ספציפיים. זוהי טכנולוגיה מאוד מודולריות שניתן להחיל לחקור כמה שונ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות לחברים של המעבדות הת’אוויי וג’ין לדיונים מועיל שלהם. המחברים מודים גם דן Crona, איאן מקדונלד בקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק R01GM118653 של ארה ב מכוני הבריאות הלאומיים (ל N.A.H.); על ידי מענקים R01GM122749, R01CA218600, R01HD088626 מ לאומי ארה ב מכוני הבריאות (כדי ג’יי ג’יי). עבודה זו גם נתמך על ידי שכבה 3 וסטודנט להעניק ממכון Eshelman UNC לחדשנות (N.A.H, A.M.C, בהתאמה). מימון נוסף GM007092 T-32 (ל A.M.C) תמיכה עבודה זו. נתונים cytometry זרימה הושג במתקן של UNC Flow Cytometry הליבה במימון P30 CA016086 סרטן מרכז הליבה תמיכה מענק UNC Lineberger מקיף במרכז לחקר הסרטן.
Materials
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
Referências
- Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
- Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Gräff, J., Tsai, L. -. H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
- Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
- Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
- Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
- Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
- Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
- Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
- Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
- Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Bioquímica. 57 (19), 2756-2761 (2018).
- Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).
