Reglering av kromatin miljön är en viktig process som krävs för korrekt genuttryck. Här, vi beskriver en metod för att kontrollera genuttryck genom rekrytering av kromatin-modifiera maskiner på ett sätt som gen-specifika och reversibla.
Reglering av kromatin packning är en viktig process som reglerar genuttryck i högre Eukaryoter. Även om kromatin kompaktering och uttryck genreglering störs ofta i många sjukdomar, har en locus-specifika, endogena och reversibel metod att studera och styra dessa verkningsmekanismer saknats. För att åtgärda det här problemet har vi utvecklat och karakteriseras romanen gen-reglerande bifunktionell molekyler. En komponent av bifunktionell molekylen binder till en DNA-protein ankare så att det kommer att rekryteras till en allel-specifika locus. Den andra komponenten engagerar endogena cellulära kromatin-modifiera maskiner, rekrytera dessa proteiner till en gen av intresse. Dessa små molekyler, som kallas kemisk epigenetiska modifierare (CEMs), klarar av att kontrollera genuttryck och kromatin miljön på ett dosberoende och reversibel sätt. Här, detalj vi ett CEM tillvägagångssätt och dess tillämpning på minska genuttryck och Histon svans acetylering på grönt fluorescerande Protein (GFP) reporter ligger på det Oct4 locus i mus embryonala stamceller (mESCs). Vi präglar ledningen CEM (CEM23) med hjälp av fluorescerande mikroskopi och flödescytometri kromatin immunoprecipitation (ChIP), följt av en kvantitativ polymeras-kedjereaktion (qPCR). Medan kraften i detta system demonstreras på det Oct4 locus, begreppsmässigt, CEM tekniken är modulära och kan appliceras i andra celltyper och på andra genetiska loci.
Kromatin består av DNA lindad runt Histon octamer proteiner som bildar kärna nukleosomens partikeln. Reglering av kromatin packning är en mycket viktig mekanism för korrekt DNA reparation, replikering och uttryck1,2,3. Ett sätt där celler styr nivån på kompaktering är genom tillägg eller borttagning av olika post-translationella Histon svans modifikationer. Två sådana ändringar omfattar (1) lysin acetylering, som oftast förknippas med gen aktivering, och (2) lysin metylering, som kan förknippas med antingen gen aktivering eller förtryck, beroende på kontexten aminosyra. Tillägg av markeringarna acetylering och metylering är katalyseras av Histon acetyltransferaser (hattar) och Histon metyltransferaser (HMTs), respektive, medan avlägsnandet av märket görs genom Histon deacetylases (HDAC) och Histon demethylases (HDMs ), respektive4,5. Även om förekomsten av dessa proteiner har varit känt i årtionden, många mekanismer av hur kromatin-ändra maskiner fungerar att ordentligt reglera genuttrycket återstår för att definieras. Eftersom kromatin tillsynsprocesser dysreglerad i många sjukdomar, kan nya mekanistiska insikter leda till framtida terapeutiska tillämpningar.
Kromatin i vivo analysen (CiA) är en nyligen beskriven teknik som använder en kemisk inducerare av närhet (CIP) för att styra kromatin-modifiera maskiner rekrytering till en viss locus6. Denna teknik har använts för att studera en växande lista av kromatin dynamik, inklusive Histon-ändra proteiner, kromatin remodelers och transkription faktorer6,7,8,9. CIP-baserade kromatin tjudra av exogent uttryckta proteiner har också förlängts förbi CiA att modulera icke-modifierade genetiska loci genom användning med en inaktiverad klustrade regelbundet mellanliggande kort Palindromic upprepar CRISPR-associerade protein (dCas9) 10 , 11. i CiA-systemet mESCs har ändrats för att uttrycka en god Jordbrukarsed reporter gen på det Oct4 locus, ett starkt uttryckt och strikt reglerade område av mESC genomet. Tidigare, detta system har använts för att beskriva dosberoende och reversibel rekrytering av exogent uttryckt Heterokromatin protein 1 (HP1), ett enzym som binder H3K9me3 och propagerar repressiva märken (t.ex., H3K9me3) och DNA metylering6. För att åstadkomma denna typ av rekryteringsstrategin, är mESCs infekterad med en plasmid som uttrycker en FK506-bindande protein (FKBP) kopplad till en Gal4, vilket är ett DNA-protein-ankare som binder till en Gal4-bindande uppsättning uppströms GFP reportern. Cellerna är också smittade med en FKBP-rapamycin-bindande domän (FRB) ansluten till HP1. När mESCs utsätts för låga nanomolar koncentrationer av CIP, rapamycin, både FRB och FKBP, sammanförs på det mål locus. Inom dagar rapamycin behandling, uttryck av målgenen är förträngt, vilket framgår av fluorescence mikroskopi och flöde flödescytometri och Histon acetylering minskas, visas av ChIP och bisulfite sekvensering. Medan utveckling och validering av detta tillvägagångssätt har varit stora framsteg inom området kromatin forskning och förordning, en nackdel är krävs exogena uttrycket av kromatin-modifiera maskiner.
För att göra tekniken baserat på rekrytering av endast endogena fysiologiskt relevanta enzymer och göra en mer modulära system, vi utformade och karakteriseras romanen bifunktionell molekyler, så kallade CEMs (figur 1)12. En komponent i CEMs inkluderar FK506, som liknar rapamycin, binder tätt och specifikt till FKBP. CEMs kommer således fortfarande att rekryteras till det Oct4 locus i den CiA-mESCs. Den andra komponenten i CEMs är en del som binder endogena kromatin-modifiera maskiner. I en pilotstudie testade vi CEMs som innehåller HDAC-hämmare. Medan begreppet med en hämmare för att rekrytera HDAC verkar kontraproduktivt intuitivt, är hämmaren ändå kunna rekrytera HDAC aktiviteter till genen av intresse. Detta åstadkoms genom att (1) omdirigera HDAC till det locus, släppa enzymet, och öka tätheten av un-hämmade HDAC i området och (2) upprätthålla HDAC hämning vid locus, men rekrytera repressiva komplex som binder till de hämmade HDAC, eller (3) en kombination av båda. I en tidigare studie visade vi att CEMs kunde framgångsrikt förtränga GFP reporter i ett dos – och tidsberoende sätt, liksom på ett sätt som var snabbt reversibel (dvs.inom 24 timmar)12. Vi kännetecknas förmågan av CEM teknik presenteras här till kontroll genuttryck med fluorescensmikroskopi, flödescytometri och förmågan för att styra kromatin miljön använder ChIP-qPCR6. Här, beskriver vi en metod för att använda och karaktärisera de CEMs, vilket kommer att underlätta anpassningen av detta system att besvara ytterligare frågor relaterade till kromatin biologi.
Här beskrev vi den nyligen utvecklat CEM system tillämpas som reglerar genuttryck och kromatin miljö på en specifik gen på ett dosberoende sätt. Vi tillhandahåller en noggrann metod för att studera dynamiken som är involverade i reglering av genuttryck genom selektiv rekrytering av specifika endogena kromatin reglerande proteiner. Detta är ett mycket modulärt teknik som kan användas för att undersöka hur olika protein – och kromatin-ändra komplex arbeta i samförstånd att ordentligt reglera kromatin milj?…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka medlemmarna i Hathaway och Jin laboratorierna för deras bra diskussioner. Författarna också tacka Dan Crona och Ian MacDonald för deras kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöds delvis av Grant R01GM118653 från amerikanska National Institutes of Health (till N.A.H.); och av bidrag R01GM122749, R01CA218600 och R01HD088626 från den amerikanska nationellt institut för hälsa (till J.J.). Detta arbete var också stöds av en tier 3 och en student bevilja från UNC Eshelman Institutet för Innovation (N.A.H och A.M.C, respektive). Ytterligare finansiering från en T-32 GM007092 (till A.M.C) stött detta arbete. Flödescytometri data erhölls vid UNC-Flow flödescytometri Core anläggningen finansieras av ett P30 CA016086 Cancer Center Core stöd bidrag till UNC Lineberger omfattande Cancer Center.
DMEM | Corning | 10-013CV | |
NEAA | Gibco | 11140-050 | |
HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
Sonicator | Covaris | E110 | |
Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
PBS | Corning | 46-013-CM | |
BSA | Fisher | BP9700 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
EDTA | Fisher | S311-100 | |
NaCl | Fisher | S271-1 | |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Tris | Fisher | BP152 | |
NP40 | Roche | 11754599001 | |
Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
Glycine | Fisher | BP381-500 | |
TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |