生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞
Summary
プロトコルの目的は、レーザー マウス眼房内で胸腺のインプラントで顕微鏡による胸腺細胞の縦の生体リアルタイム追跡を示すことです。角膜の透明性と血管新生血管前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口を継続的に記録が可能です。
Abstract
提示されているメソッドの目的は、最初の時間のため、新生児 thymi生体内で縦のリアルタイム モニタ リング、血管内 thymocytes´ ダイナミクスの同質の成体マウスの前眼房への移植を表示するは胸腺のセグメント。次の移植、レーザー顕微鏡 (LSM) 角膜は、携帯電話の解像度レベルでの繰り返し非侵襲的イメージング体内をことができます。重要なは、アプローチに追加しますイメージング モデル以前の生体の T 細胞の成熟に連続前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口の録音の可能性同じ動物。システムの付加的な利点は、移植組織の巨視的急速な監視を許可する接木部透明性と全身トリートメントに加え、インプラントへのアクセシビリティがローカライズされました。組織のボリュームをされている主な制限するは葉のトリミングを要求する目の商工会議所の省スペースに収まります。オルガンの整合性は、成熟した T 細胞の生産で機能する以前にパターンで胸腺ローブを解剖によって最大化されます。技術は可能性のある自己免疫疾患、免疫不全、中枢性トレランス; を含む胸腺機能に関連する医学的に関連の質問の環境調査に適していますプロセス定義が不十分な機械論的に残っています。胸腺細胞の移動、分化と選択を導くメカニズムの細かい解剖は、新規治療戦略開発 T 細胞をターゲットにつながるはずです。
Introduction
胸腺内 T 細胞分化と T 細胞亜集団の選択は、開発と脊椎動物1の細胞性免疫能の維持のため重要なプロセスを構成します。このプロセスは、複雑な一連の血流や細胞増殖の移行から前駆細胞の募集、サブセットの大規模なプログラム細胞死および膜タンパク質の発現を含むしっかりと組織のイベント選択します。結果は最小化された自己のペプチッド、レスポンスを表示しながら、成熟 T 細胞に外国の抗原の広いスペクトル反応のリリースを最後まで個々2,3の末梢リンパ器官を植民地化します。ΑβTCR レパートリーの迷入胸腺選択は、自己免疫疾患や免疫のアンバランス4主に正または負の前駆体選択の過程それぞれ欠陥から派生したに します。
胸腺で胸腺細胞の方向性の移行は T 細胞の成熟のすべての段階に組み込み、ケモカイン、接着剤を含む複数の刺激、同時またはシーケンシャルのシリーズとして構想・解消接着細胞外マトリックス (ECM)蛋白質の相互作用の3、5。固定組織の研究が表示される定義された胸腺微小5,6、渡り鳥のキューの胸腺細胞の表現のパターンに関する重要な情報ex vivoの研究は 2 つを明らかにした流行胸腺細胞器官の 2 つの組織の領域の移住性の動作: 遅い確率的な運動皮質と髄質7,8,9,10高速、限られた運動,11,12,13。 胸腺の肯定的な選択13と渡り鳥の増加率の相関と負の淘汰は胸腺旅の速度が適切なを決定すること仮説を支えるクロールの動作に関連付けられています。胸腺細胞の成熟。その妥当性にもかかわらず胸腺間質細胞の相互作用のトポロジおよび T 細胞の成熟に伴う臓器微小で胸腺細胞運動のダイナミクスは不明確なままです。
ほとんどは、前のヴィヴォの日付に対して研究胎児または胸腺器官培養14,15、切片または胸腺細胞の動きが 2 光子レーザーのスキャンによって可視化してそのまま胸腺葉外植片を再集約顕微鏡 (TPLSM)8、制限最大作動距離および組織に従い 1 mm の深さのイメージングと生体イメージング技術は、16を検討しました。胸腺スライス技術と特定のサブセットのままの胸腺葉アプローチ許可制御導入の両方であらかじめラベル 3 D 構造を形成する長期の潜伏時間に依存する骨の折れる胸腺器官培養と対照をなしてネイティブの組織アーキテクチャ環境に胸腺細胞。ただし、血流があるので欠席これらのモデルで胸腺胸腺実質または成熟 T 細胞の胸腺の egression のダイナ ミックス (Tsp) 前駆細胞をセトリングの採用プロセスを研究するため明確に限定されます。
In vivoモデル マウスにおける胸腺 T 細胞の成熟の生理学の研究のためには、全体の器官葉腎カプセル17または掻き18内に配置またはフラグメントの移植が含まれます。動物の奥深くまたは不透明な組織の層で覆われている胸腺移植片の位置が体内でインプラントの検査のための使用を制限がこれらのオプションは、組織の機能生着全身を尋問する彼らの有用性を示したTPLSM。
目の前房は角膜のレイヤーの透明度のおかげで、移植組織の直接監視の簡単にアクセスできるスペースを提供します。利点の虹彩によって形成されたチャンバのベースは血管や自律神経終末、急激な血行再建術と移植19,20の神経再生を有効にするが豊富です。博士カイセードがメンテナンスおよび過去21膵島の縦断的研究のためこの解剖学的領域を使用して正常に。ここで、紹介はこの戦略だけでなくネイティブ器官の構造内の胸腺細胞のダイナミクスを研究するための有効なアプローチを構成するも一意に前駆募集の研究に縦の録音は、生体内で拡張することができますが、マウス成熟 T 細胞 egression の手順。
Protocol
Representative Results
Discussion
個々 の免疫能力4 T 細胞の成熟過程の重要性と成熟 T 細胞胸腺2,3プロデュースの前駆細胞の動態の推定の影響のため多大な努力に投資されています。古典的な組織を固定する選択肢を開発するアプローチをスナップショットしました。
研究での使用組織スライスとその他の植が明らかに単分子膜または集計の?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は NIH 助成金 R56DK084321 (AC)、R01DK084321 (AC)、R01DK111538 (AC)、R01DK113093 (AC)、R21ES025673 (AC) とベスト/2015/043 グラント サポートされている (Consellería ・ デ ・ Educació、文化会館私 esport、ジャナラリター バレンシア, バレンシア, スペイン) (EO)。サンペドロマルティル山脈バレンシア バレンシア ・ カトリカ大学サン ・ ビセンテ、スペイン、ビデオ撮影・編集のセントロ ・ デ ・危惧プリンシペ フェリペ、バレンシア、スペインでアルベルト ・ エルナンデスに送信チームを著者に感謝します。
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
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