Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.
Abstract
Uma primeira abordagem para estudar a função de um gene desconhecido em bactérias é criar um knock-out deste gene. Aqui, descrevemos um protocolo robusto e rápido para transferência de mutações do gene exclusão de uma estirpe de Escherichia coli para outro usando transdução generalizada com o bacteriófago P1. Este método requer que a mutação seja selecionável (por exemplo, baseado em interrupções de gene usando inserções de gaveta antibiótico). Tais fitas antibióticas podem ser mobilizadas a partir de uma estirpe de doador e introduziram uma destinatário estirpe de interesse para rapidamente e facilmente geram um mutante de apagamento do gene. A gaveta antibiótica pode ser projetada para incluir sites de reconhecimento de flipase que permitem que a excisão da fita por um site-specific recombinase para produzir um nocaute limpo com apenas uma sequência de ~ 100-base-par-longa cicatriz no genoma. Demonstramos o protocolo ao nocautear o gene de tamA codifica um fator de montagem envolvido na biogênese de autotransporter e testar o efeito desse nocaute sobre a biogênese e a função de dois autotransporter trimeric adesinas. Embora a supressão do gene por transdução P1 tem suas limitações, a facilidade e rapidez de sua implementação seja uma alternativa atraente para outros métodos de apagamento do gene.
Introduction
Uma primeira abordagem comum para estudar a função de um gene é executar o mutagenesis de mata-mata e observar o fenótipo resultante. Isto também é denominado genética reversa. A bactéria e. coli tem sido o carro-chefe da biologia molecular nos últimos 70 anos, ou então, devido à facilidade do seu cultivo e sua acessibilidade para manipulação genética1. Vários métodos foram desenvolvidos para produzir exclusões de gene em e. coli, incluindo troca de marcador a mutagênese2,3 e, mais recentemente, recombineering usando o λ vermelho ou Rac ET sistemas4,5 , 6.
Em um sistema amplamente utilizado, codificação de sequências de genes individuais são substituídas por uma gaveta de resistência aos antibióticos que pode mais tarde ser extirpada do cromossoma5,7. As sequências de codificação são substituídas, por exemplo, uma gaveta de resistência de canamicina (Kan), que é ladeada por sites de destino (FRT) de reconhecimento de flipase (FLP) em ambos os lados. Os sites da FRT são reconhecidos pela recombinase FLP, que medeia a site-specific recombinação entre os sites FRT, levando à supressão da fita Kan. Desta forma, uma exclusão total de sequência de código de um determinado gene pode ser conseguida, deixando para trás apenas uma sequência de cicatriz mínima de aproximadamente 100 pares de bases (bp) (Figura 1).
Pouco mais de uma década atrás, foi desenvolvida a coleção chamada de Keio. Esta é uma biblioteca bacteriana com base em um padrão de laboratório cepa de Escherichia coli K12, onde quase todos os genes não essenciais foram individualmente excluídos por λ recombinação vermelho7,8. Os clones dentro de cada coleção tem uma sequência de código substituída com uma gaveta de resistência Kan sujeitas. A coleção de Keio provou para ser uma ferramenta útil para muitas aplicações9. Uma tal aplicação é a produção de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . A gaveta de Kan de um clone de exclusão determinada pode ser mobilizada por geralmente transducing bacteriófagos, tais como P110,11,12,13,14. Um estoque de fago preparado a partir de uma tensão tão grande pode ser usado para infectar um destinatário Escherichia coli cepa de interesse, onde em uma frequência baixa, mas de confiança o Kan região contendo gaveta pode ser incorporada o genoma destinatário por recombinação homóloga (Figura 2). Transductants podem ser selecionados para o crescimento em meio de Kan-contendo. Em seguida, se a remoção da fita resistência aos antibióticos é desejada, a recombinase FLP pode ser fornecido para a estirpe transductant em trans. Após a cura o plasmídeo contendo FLP, que transporta um marcador de resistência a ampicilina (Amp), clones de Kan e Amp-sensíveis são selecionados para, e a correta excisão de sequência de codificação a selvagem-tipo e a gaveta de Kan são verificadas por PCR de colônia.
Aqui, é apresentado um protocolo detalhado, descrevendo cada uma das etapas na produção de uma estirpe de Escherichia coli , baseado na estratégia delineada acima de mata-mata. Como exemplo, uma deleção do gene da tamA é demonstrada. tamA codifica uma proteína de β-barril de membrana exterior que é uma parte do transporte e módulo de montagem (TAM), que está envolvida na biogênese de certas proteínas autotransporter e pili15,16,17. Esta estirpe de mata-mata foi usado para examinar o efeito da exclusão tamA sobre a biogênese de dois autotransporter trimeric adesinas (TAAs), a Yersinia adesina YadA e a Escherichia coli imunoglobulinas (Ig)-vinculação TAA EibD 18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transdução de P1 é um método rápido, robusto e confiável para a geração de exclusões de gene em e. coli. Isso é demonstrado aqui pelo transducing um mutante de exclusão de tamA de uma estirpe de doador de Keio para um destinatário BL21-derivado. As grandes etapas do processo de transdução são a produção do transducing lisada, a transdução em si, a excisão da fita Kan resistência e a verificação do knock-out pelo PCR. No total, o processo leva cerca de 1 semana e requer sem método…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cepas de coleção de Keio foram obtidas a partir do projeto nacional de BioResource (NIG, Japão): Escherichia coli. Agradecemos seu apoio contínuo Dirk Linke (departamento de Biociências, Universidade de Oslo). Este trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa da Noruega jovem pesquisador grant 249793 (Jack C. Leo).
Materials
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
Referências
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