Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Abstract

Een eerste benadering voor het bestuderen van de functie van een onbekend gen in bacteriën is het creëren van een knock-out van dit gen. Hier beschrijven we een krachtige en snelle protocol voor het overbrengen van genmutaties schrapping van een Escherichia coli -stam naar de andere met behulp van gegeneraliseerde transductie met de bacteriofaag P1. Deze methode vereist dat de mutatie selecteerbare (bijvoorbeeld op basis van gene verstoringen met behulp van antibiotica cassette invoegingen). Dergelijke antibiotica cassettes kunnen worden gemobiliseerd van een donor-stam en geïntroduceerd in een ontvangende stam van belang om snel en eenvoudig genereren van een gen schrapping mutant. De antibiotica cassette kan worden ontworpen om flippase erkenning sites waarmee de excisie van de cassette door een site-specific recombinase tot een schone knock-out met alleen een opeenvolging van ~ 100-base-paar-lang litteken in het genoom. We tonen het protocol door het gen van de tamA codering een vergadering factor die betrokken zijn bij de autotransporter biogenese uitsparen en testen van het effect van deze knock-out op de biogenese en functie van twee trimeric autotransporter adhesines. Hoewel gene schrapping door P1 transductie zijn beperkingen heeft, maken het gemak en de snelheid van de uitvoering ervan het een aantrekkelijk alternatief voor andere methoden van gene verwijdering.

Introduction

Een gemeenschappelijke eerste aanpak voor het bestuderen van de functie van een gen is het uitvoeren van knock-out mutagenese en observeren van de resulterende fenotype. Dit heet ook omgekeerde genetica. De bacterie van E. coli is het werkpaard van de moleculaire biologie om de laatste 70 jaar of zo, ten gevolge van het gemak van het kweken en haar inschikkelijkheid aan genetische manipulatie-¹. Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het produceren van gene verwijderingen in E. coli, waaronder markeerdraad uitwisseling mutagenese^2,3 en, meer recent, recombineering met de λ rood of Rac ET systemen^{4,5 , 6}.

In een veelgebruikt systeem, worden codering sequenties van afzonderlijke genen vervangen door een antibiotica-resistentie-cassette die later kan worden weggesneden uit de chromosoom^5,7. De codering sequenties worden vervangen, bijvoorbeeld door een cassette kanamycine (Kan) weerstand, die wordt geflankeerd door flippase (FLP) erkenning doel (FRT) sites aan beide zijden. De FRT sites worden herkend door de recombinase FLP, die site-specifieke recombinatie tussen de sites van de FRT leiden tot het schrappen van de cassette Kan doorgeeft. Op deze manier kan een volledige schrapping van een bepaalde de codering gensequentie worden bereikt, weggaand achter slechts een minimale litteken opeenvolging van ongeveer 100 basenparen (bp) (Figuur 1).

Iets meer dan een decennium geleden, werd de zogenaamde Keio-collectie ontwikkeld. Dit is een bacteriële bibliotheek op basis van een standaard laboratorium E. coli K12 stam, waar bijna alle niet-essentiële genen individueel werden geschrapt door λ rode recombinatie^7,8. De klonen binnen deze collectie hebben één codering opeenvolging een accijns Kan weerstand cassette hebt vervangen. De Keio-collectie heeft bewezen een nuttig hulpmiddel voor veel toepassingen⁹. Een dergelijke toepassing is de productie van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . De cassette Kan uit een bepaalde schrapping kloon kan worden gemobiliseerd door in het algemeen transducing bacteriofagen, zoals P1^{10,11,12,13,14}. Een voorraad van de bacteriofaag bereid uit een dergelijke stam kan vervolgens worden gebruikt om te infecteren een geadresseerde E. coli stam van belang, waar met een laag maar betrouwbare frequentie de Kan cassette-bevattende regio kan worden opgenomen in het ontvangende genoom van homologe recombinatie (Figuur 2). Transductants kunnen worden geselecteerd voor de groei op het medium Kan bevatten. Na dit, indien verwijdering van de antibiotica-resistentie-cassette is gewenst, kan het FLP-recombinase worden geleverd aan de transductant-stam in trans. Na het uitharden van het FLP-bevattende plasmide, die draagt een marker van de weerstand ampicilline (Amp), Kan en Amp-gevoelige klonen zijn gescreend en de juiste excisie van de wild-type codering sequentie en de cassette Kan worden geverifieerd door PCR van de kolonie.

Hier, wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd, met een beschrijving van elk van de stappen in het produceren van een knock-out E. coli stam gebaseerd op de hierboven beschreven strategie. Als voorbeeld, wordt een schrapping van de tamA gen aangetoond. tamA codeert een buitenmembraan β-vat-eiwit dat behoort tot het vervoer en de vergadering Module (TAM), die bij de biogenese van bepaalde autotransporter eiwitten en pili^{15,16,17 betrokken is}. Deze spanning knock-out werd vervolgens gebruikt om te onderzoeken van het effect van de schrapping van de tamA op de biogenese van twee trimeric autotransporter adhesines (TAAs), de Yersinia antistoffen YadA en de E. coli immunoglobulin (Ig)-bindende TAA EibD ^18,19.

Protocol

1. de stammen en plasmiden Bacteriestammen Gebruik de E. coli stammen BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7en BL21(DE3)20BL21ΔABCF21. Zie Tabel van materialen voor meer informatie. Bacteriofagen Gebruik de bacteriofaag P1vir voor de algemene transductie. De faag opslaat als een vloeibare voorraa…

Representative Results

Generatie van een tamA Knock-out van BL21ΔABCF: De hierboven beschreven strategie heeft eerder gebruikt voor de productie van een afgeleide stam van BL21(DE3), de stam van een standaard laboratorium gebruikt voor de productie van eiwitten, die is geoptimaliseerd voor de productie van de eiwitten van de buitenmembraan en genaamd BL21ΔABCF21. Deze spanning mist vier genen die coderen voor overvloedi…

Discussion

P1 transductie is een snelle, robuuste en betrouwbare methode voor het genereren van gene verwijderingen in E. coli. Dit blijkt hier uit een tamA schrapping mutant van een Keio donor-stam naar een geadresseerde BL21-afgeleide transducing. De grote fasen in het proces van de transductie zijn de productie van de transducing lysate de signaaltransductie zelf, de besnijdenis van de cassette Kan weerstand en de verificatie van de knock-out door PCR. In totaal, het proces duurt ongeveer 1 week en vereist geen…

Materials

Strains
E. coli BW25113	NIG	ME6092	Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3)	Merck	69450-3	Expression strain
E. coli BL21DABCF	Addgene	102270	Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179	NIG	JW4179-KC	tamA deletion mutant
P1 vir	NIG	HR16	Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20	CGSC	14177	conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2	IBA GmbH	2-1301-000	expression vector
pEibD10	N/A	N/A	for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+	Merck	69744-3	expression vector
pIBA2-YadA	N/A	N/A	for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid	ThermoFisher	33209
Agar	BD Bacto	214010
Agarose	Lonza	50004
Ampicillin	Applichem	A0839
Anhydrotetracycline	Abcam	ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1	Sigma	C2456
Bovine collagen type I	Sigma	C9791
Calcium chloride	Merck	102382
Chloroform	Merck	102445
Di-sodium hydrogen phosphate	VWR	28029
DNA dye	Thermo	S33102
DNA molecular size marker	New England BioLabs	N3232S
DNase I	Sigma	DN25
dNTP mix	New England Biolabs	N0447
ECL HRP substrate	Advansta	K-12045
EDTA	Applichem	A2937
Glycerol	VWR	24388
goat anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP	Agrisera	AS10668
HEPES	VWR	30487
Isopropyl thiogalactoside	VWR	43714
Kanamycin	Applichem	A1493
Lysozyme	Applichem	A4972
Magnesium chloride	VWR	25108
Manganese chloride	Sigma	221279
N-lauroyl sarcosine	Sigma	L9150
Skim milk powder	Sigma	70166
Sodium chloride	VWR	27808
tamA forward primer	Invitrogen	N/A	Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer	Invitrogen	N/A	Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase	New England Biolabs	M0267
Tri-sodium citrate	Merck	106448
Tryptone	VWR	84610
Tween20	Sigma	P1379
Yeast extract	Merck	103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber	Hoefer	SUB13
Bead beater	Thermo	FP120A-115
CCD camera	Kodak	4000R
Electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2089
Electroporation unit	Bio-Rad	1652100
Gel imager	Nippon Genetics	GP-03LED
Incubating shaker	Infors HT	Minitron
Incubator	VWR	390-0482
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Microwave oven	Samsung	CM1099A
PCR machine	Biometra	Tpersonal
PCR strips	Axygen	PCR-0208-CP-C
pH meter	Hanna Instruments	HI2211-01
PVDF membrane	ThermoFisher	88518
SDS-PAG electrophoresis chamber	ThermoFisher	A25977
Tabletop centrifuge	Beckman Coulter	B06322
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236
Water bath	GFL	D3006
Wet transfer unit	Hoefer	TE22