効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化
Summary
このプロトコルは、xeno ・ フィーダー細胞フリー培養条件下でのひと多能性幹細胞から角膜輪部上皮幹細胞の差別化のための単純な 2 段階法を紹介します。ここで示した細胞培養法は、医療の質細胞、角膜上皮細胞療法の使用に適用される低コスト大量生産を有効にします。
Abstract
角膜輪部上皮幹細胞 (LESCs) は、角膜上皮を継続的に更新し、角膜の恒常性と映像の明瞭さを維持します。ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生 LESCs 角膜細胞補充療法の有望な細胞供給源を提供します。未定義、異種文化および分化条件は研究結果の変動を引き起こすし、hPSC から派生した治療の臨床の翻訳を妨げます。このプロトコルは、xeno ・ フィーダー細胞由来無細胞の条件の下で hPSC LESC 分化の再現性と効率的な方法を提供します。まず、組換えラミニン 521 (LN-521) と定義されている hPSC の中で画一的な hPSC の単層培養分化の高品質原料の生産のための基盤として提供しています。第二に、簡易 hPSC LESC 微分法は、わずか 24 日間で LESC 集団を生成します。このメソッドには、定義された角膜上皮分化培地での IV 型コラーゲン LN-521/組み合わせで付着性文化相が続く、小分子と懸濁液中 4 日表層外胚葉誘導が含まれています。Cryostoring と拡張分化さらにセル人口を浄化し、細胞療法製品の大量に細胞の銀行を有効にします。結果として得られる高品質の hPSC LESCs は、輪部幹細胞欠乏症 (LSCD) を治療するために角膜の表面再構成のための潜在的な新規治療戦略を提供します。
Introduction
眼表面で透明な角膜、網膜に入力する光と目の屈折力の大半を提供できます。最も外側の層は、重層の角膜上皮は、輪部上皮幹細胞 (LESCs) によって継続的に再生成されます。LESCs はして角膜ジャンクション1,2輪部のニッチの基底層に存在します。LESCs は、同定推定マーカーの一連のより広範な分析が必要ですので、具体的かつユニークなマーカーを欠いています。上皮性転写因子 p63、特に N 末端切り捨てられた謄本 p63 のアルファのアイソ フォーム (ΔNp63α) は、関連する肯定的な LESC マーカー3,4として提案されています。LESCs の非対称分裂自己更新しますが、また centripetally と前方移行子孫を生成することができます。セルに向かって前進する角膜の表面に徐々 に自分の幹細胞性を失うし、最終的に末期患者が継続的に角膜の表面から失われる表層の扁平上皮細胞に区別するため。
重度の視覚障害につながることができますいずれかの角膜の層への損傷と角膜欠損を世界的な視野の損失の導く原因の 1 つ。輪部幹細胞 (LSCD) の欠乏症で、角膜が病気や conjunctivalization や角膜の混濁、ビジョン5,6のそれに続く損失につながる外傷によって破壊されました。自家および同種の輪部移植を用いた細胞補充療法は、LSCD4,7,8,9症例に対する治療戦略を提供しています。健康な眼に合併症のリスクを負う自家移植を収穫し、ドナー組織が不足します。ひと多能性幹細胞 (hPSCs)、ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs)、具体的には、臨床的に関連する細胞の種類、角膜上皮細胞を含む無制限のソースとして使用できます。したがって、hPSC から派生した LESCs (hPSC-LESCs) は、眼セル置換療法のための魅力的な新しい細胞ソースを表します。
伝統的に、未分化 hPSC 培養法とその微分のプロトコル LESCs に未定義のフィーダー細胞、動物血清、エアコンのメディア、または羊膜10、11,の使用に依存しています。12,13,14,15. 最近、細胞療法製品を安全への取り組みより標準化された、無料の異種文化および分化プロトコルの検索を求めています。その結果、画一的な hPSCs の長期培養定義、xeno 無料方法はいくつかは、市販16,17,18をされます。連続体、角膜上皮の運命に hPSCs を誘導する分子手掛かりに依存するプロトコルが最近されている分化紹介19,20,21,22、 23。まだこれらのプロトコルの多くは材料、または分化のための複雑な異種の成長因子カクテルを開始としてどちらかの未定義、フィーダー ベースの hPSCs を使用しました。
このプロトコルの目的は、信頼性の高い、最適化された、xeno を提供するために-hPSC のフィーダー フリー培養法と角膜 LESCs へのそれに続く分化。ラミニン 521 (LN-521) 行列 (具体的には不可欠な 8 フレックス) 定義、アルブミン無料 hPSC 中に多能性 hPSCs の単層培養により分化の均質な出発物質の迅速な生産ができます。その後、単純な 2 段階差別化戦略は懸濁液、LESCs に、付着性の分化に続く表面の外胚葉運命に向かって hPSCs をガイドします。> 65% が ΔNp63α を表現する細胞集団は 24 日以内に取得されます。Xeno とフィーダー フリー プロトコルは、セルの行の特定の最適化の必要はなく、いくつかの hPSC ライン (hESCs と hiPSCs の両方) のテストされています。週末無料メンテナンス、継、cryostoring、hPSC LESC フェノタイピングここで説明のためのプロトコルのための高品質 LESCs の大規模なバッチの生産を有効に臨床や研究の目的。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの期待される結果は、約 3.5 週間以内 FF hPSC の単一細胞懸濁液から LESCs の成功で堅牢な世代です。表面の外胚葉29から角膜上皮が発展すると、プロトコルの最初のステップはこの系譜に向かって hPSCs のステアリングを目指しています。増殖因子 β (TGF-β) 拮抗薬、SB 505124 と bFGF の変換と短い 24 h 誘導、48 h 中胚葉性の BMP 4 キューへ表面の外胚葉細胞をプッシ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
調査は技術と革新のフィンランド (許可番号 297886) のアカデミー、フィンランド技術庁、フィンランドの資金配分機関の人間スペアパーツ プログラムによってサポートされたフィンランドの目およびティッシュ銀行財団とフィンランド文化財団。著者は、優秀なテクニカル サポートと細胞培養への貢献のために医学の技工 Outi Heikkilä エマ Vikstedt、ハンナ Pekkanen Outi Melin をありがとうございます。教授 Katriina アアルト Setälä は、蛍光イメージングのための機器を提供するため使用ことラインと BioMediTech イメージングの中核施設を提供するために認められています。
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
Referências
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye–a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
- International Stem Cell Initiative, , et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
