TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Summary

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l’analisi di modifica dell’istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

Abstract

Regolazione epigenetica svolge ruoli centrali nell’espressione genica. Dal momento che la modifica dell’istone è stato scoperto nel 1960, le sue funzioni fisiologiche e patologiche sono stati studiati estesamente. Infatti, l’avvento della nuova generazione sequenziamento profondo e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) via gli anticorpi specifici istone modifica ha rivoluzionato il nostro punto di vista della regolazione epigenetica in tutto il genoma. Al contrario, tessuti in genere consistono di tipi cellulari diversi e loro miscela complessa pone sfide analitiche ad indagare l’epigenoma in un tipo di cella specifica. Per risolvere lo stato di tipo-specific cromatina delle cellule in un modo del genoma, recentemente abbiamo sviluppato il sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq), che è basato sulla purificazione selettiva della cromatina di proteine istoniche core contrassegnati dalla cella tipi di interesse, seguita da ChIP-seq. L’obiettivo del presente protocollo è l’introduzione delle migliori pratiche di tChIP-segg. Questa tecnica fornisce uno strumento versatile per epigenome tessuto-specifica indagine in modificazioni istoniche diversificata e organismi modello.

Introduction

Tessuti di animali consistono di tipi cellulari diversi. La regolazione genica in ogni cella definisce il tipo di cella. Modificazioni della cromatina – modifica del DNA di metilazione e istone – sono alla base della specificità di cellula-tipo dell’espressione genica. Così, la misura della regolazione epigenetica in ciascun tipo di cella è stata voluta, ma è stato una sfida tecnica.

Per studiare l’epigenetica in un tipo di cellula particolare, sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq) è stato sviluppato di recente (Figura 1)¹. In tChIP, proteina di nucleo epitopo-etichetta dell’istone H2B è espresso da un promotore di cellula-tipo-specifico. Questa funzione permette l’isolamento di cromatine dalle celle di interesse, anche se il materiale viene avviato da una miscela di vari tipi cellulari. Seguenti ChIP-Seq — purificazione della cromatina attraverso un contrassegno dell’istone per volta e generazione sequenziamento profondo del DNA isolato — possiamo monitorare lo stato epigenetico del tipo cellulare mirati in maniera genoma.

Usando questa tecnica, abbiamo recentemente studiato trimethylation di neurone-specific dell’istone H3 proteina a lisina 4 (H3K4me3) marchi. In quello studio, abbiamo sviluppato un topo knock-nel quale C-terminale Bandierina-etichettate H2B proteina è stata espressa su ricombinazione Cre-mediata (Rosa26^{CAG floxed-pA H2B-bandiera}). Dall’incrocio con un mouse che possiedono il gene Cre-reticolo endoplasmatico endoplasmatico (ER) sotto il controllo del promotore CamK2a, la linea di topo ottenuti indotta H2B-bandiera in neuroni attivi su tamoxifen iniezione (Camk2a^H2B-bandiera)¹. A partire dal cervello della riga del mouse stabilito, abbiamo effettuato tChIP-Seq con anticorpo anti-H3K4me3. Poiché H3K4me3 marchi corrispondono spesso a regioni promotrici, potremmo scoprire centinaia di mRNAs specificamente espressi nei neuroni¹.

Qui, descriviamo un metodo tipico tChIP-Seq che copre le misure da dissezione del tessuto per la costruzione della libreria (Figura 1). L’obiettivo finale di questo protocollo è quello di condividere le nostre best practice per le prestazioni di tChIP-Seq e la futura applicazione di questo metodo ad altri tipi di cellule e modificazioni istoniche.

Protocol

Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dalla divisione sicurezza di RIKEN (H27-EP071) e condotti con regolamenti e linee guida pertinenti. 1. dissezione del tessuto Sezionare i tessuti di interesse in piccoli pezzi (circa < 3 mm2) usando le forbici di primavera.Nota: Frammenti di tessuto più grandi richiedono più tempo per congelare, e pezzi più piccoli verranno riporto più grandi volumi di tampone, entrambi i quali possono alterare i …

Representative Results

Qui, descriviamo la dissezione del tessuto, fissazione, lisi cellulare, purificazione tandem della cromatina e preparazione libreria DNA Sequencer di prossima generazione. Durante le procedure, si può testare la qualità del DNA, che è la chiave del successo sequenziamento, a più passaggi (Figura 2). Poiché un singolo nucleosoma è in genere circondato da 147 bp DNA 4, tranciata DNA non dovrebbe essere più breve di quella dimensio…

Discussion

Il nostro protocollo è stato ottimizzato per i neuroni del cervello del mouse, in cui l’espressione della bandierina-etichettate H2B è indotto tramite l’iniezione di tamoxifene. I promotori utilizzati per H2B espressione, materiali di base del tessuto e la quantità dei tessuti sono parametri chiave per successo tChIP-segg. Così, l’ottimizzazione di questi fattori da considerare per ogni tipo di cellula di interesse.

Un passaggio fondamentale tra le procedure utilizzate in questo protocollo…

Materials

Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region