Analyse du Cycle cellulaire dans la lignée germinale de c. elegans avec la Thymidine Analog EdU
Summary
On décrit une méthode axée sur l’imagerie qui peut être utilisé pour identifier la phase S et analyser la dynamique du cycle cellulaire dans le c. elegans de germline hermaphrodite à l’aide de la thymidine EdU analogique. Cette méthode ne nécessite aucun transgènes et est compatible avec la coloration par immunofluorescence.
Abstract
Analyse du cycle cellulaire chez les eucaryotes utilise fréquemment la morphologie des chromosomes, expression et/ou la localisation des produits des gènes requis pour les différentes phases du cycle cellulaire, ou l’incorporation d’analogues nucléosidiques. Au cours de la phase S, ADN polymérases incorporent analogues de la thymidine par exemple EdU ou BrdU dans l’ADN chromosomique, marquage des cellules pour l’analyse. Pour c. elegans, le nucléoside EdU analogique est alimenté à la worms durant la culture ordinaire et est compatible avec les techniques d’immunofluorescence. La lignée germinale de c. elegans est un système puissant modèle pour les études de la signalisation des voies, cellules souches, la méiose et cycle cellulaire parce qu’il est transparent, génétiquement facile, et la prophase méiotique et différenciation cellulaire/gamétogenèse se produisent dans un Assemblée-comme la mode linéaire. Ces caractéristiques font de EdU un excellent outil pour étudier les aspects dynamiques des cellules mitotiquement cyclisme et développement de la lignée germinale. Ce protocole décrit comment correctement préparer EdU bactéries, nourrissez-les à sauvage c. elegans hermaphrodites, disséquer la gonade hermaphrodite, détachant pour EdU incorporation dans l’ADN, détachant avec les anticorps pour détecter différents cycle cellulaire et les marqueurs du développement, l’image de la gonade et analyser les résultats. Le protocole décrit les variations dans la méthode et l’analyse pour la mesure de phase S index, phase M index, G2 durée, durée du cycle cellulaire, taux d’entrée méiotique et taux de progression de la prophase méiotique. Cette méthode peut être adaptée à l’étude du cycle cellulaire ou l’histoire de la cellule dans d’autres tissus, stades, antécédents génétiques et des conditions physiologiques.
Introduction
En développement animal, centaines, milliers, millions, milliards ou même des trillions de divisions cellulaires sont nécessaires pour former l’organisme adulte. Le cycle cellulaire, composé de l’ensemble des événements cellulaires de G1 (gap), S (synthèse), G2 (gap), et M (mitose) définissent la série d’événements qui sont exécutées à chaque division cellulaire. Le cycle cellulaire est dynamique et mieux appréciée en temps réel, qui peut être techniquement difficile. Les techniques présentées dans le présent protocole permettent d’effectuer les mesures des phases et le calendrier du cycle cellulaire des images fixes.
Marquage avec des analogues de nucléosides comme 5-éthynyl-2′-déoxyuridine (EdU) ou 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) est l’étalon-or pour identifier la phase S dans les études de la dynamique du cycle cellulaire chez l’adulte Caenorhabditis elegans (c. elegans) lignée germinale hermaphrodite1,2,3,4,5. EdU et BrdU peuvent être utilisé dans presque n’importe quel fond génétique, car ils ne reposent pas sur n’importe quelle construction génétique. Visualisation BrdU nécessite un traitement chimique sévère pour exposer l’antigène anticorps anti-BrdU, coloration, qui est souvent incompatible avec l’évaluation d’autres marqueurs cellulaires visualisées par la souillure conjointement avec d’autres anticorps. En revanche, la visualisation EdU s’effectue par chimie de clic dans des conditions douces et est donc compatible avec anticorps co coloration6,7.
La spécificité de l’étiquette est évidente, puisque les noyaux incorporent seulement les analogues (5-éthynyl-2′-déoxyuridine) de thymidine dans l’ADN au cours de la phase S. Visualisation se déroule dans le tissu fixe. L’étiquette EdU est invisible par lui-même jusqu’à un colorant contenant de l’azide ou fluorophore réagit par liaison covalente avec l’alcyne en EdU par clic catalysé par le cuivre chimie8. EdU étiquetage peut fournir des informations immédiates sur lequel les noyaux sont en phase S, à l’aide d’une brève impulsion d’étiquetage. EdU peut également fournir des informations dynamiques, à l’aide de pulse-chase ou marquage continu ; par exemple, dans une expérience de chasse, l’étiquette est dilué à chaque division cellulaire soit propagée aussi ne se divisant pas cellules progrès par le développement.
La lignée germinale hermaphrodite de c. elegans est un système puissant de modèle pour les études de la signalisation des voies, des cellules souches, la méiose et cycle cellulaire. La lignée germinale adulte est une chaîne de montage polarisée avec des cellules souches à l’extrémité distale, suivie de l’entrée et la progression à travers la prophase méiotique, coordonnée avec les stades de la gamétogenèse plus proximale (Figure 1). À l’extrémité proximale, ovocytes matures, sont ovulés et fertilisé et commencent l’embryogenèse dans l’utérus9,10,11. La région de long ~ 20 cellules de diamètre près du capteur de l’extrémité distale, qui comprend la tige de la lignée germinale mitotiquement cyclisme, cellules progénitrices et cellules en phase S méiotiques mais pas les cellules en prophase méiotique, s’appelle l’ancêtre zone2,4 , 9 , 12. les membranes des cellules fournissent une séparation incomplète entre les noyaux dans la lignée germinale distale, mais les cellules progénitrices de la zone subissent une mitose cellule cyclisme en grande partie indépendamment. La durée médiane cycle cellulaire mitotique des cellules de la zone germinale progénitrices en jeunes adultes hermaphrodites est ~6.5 h ; La phase G1 est brève ou absent, et le repos n’est pas observé de1,2,13. Différenciation des cellules souches germinales se fait par différenciation essentiellement directe et donc n’a pas de titres de transport en commun-amplification4. Au cours de la différenciation dans le stade pachytène, environ 4 des 5 noyaux ne feront pas d’ovocytes mais plutôt apoptose, agissant comme cellules nourricières en faisant don de leur contenu cytoplasmique à l’ovocyte en développement12,14 , 15.
En plus de l’étiquetage des cellules en phase S avec les analogues nucléosidiques, on peut identifier les cellules en mitose et méiose utilisant des anticorps. Lors de la mitose, les noyaux sont immunoréactives à anti-phospho-histone H3 (Ser10) anticorps (appelé pH3)7,16. Lors de la méiose, les noyaux sont immunoréactives à anticorps anti-lui-3 (une protéine d’axe méiotique)17. Noyaux dans la zone de souches peuvent être identifiées par l’absence de HIM-3, la présence de nucléoplasmique REC-818ou la présence de WAPL-119. WAPL-1 intensité est plus élevée dans la gonade somatique, élevée dans la zone de l’ancêtre et faible pendant début prophases méiotiques19. Plusieurs mesures de cycle cellulaire sont possibles avec quelques variations dans le protocole : J’ai) identifier les noyaux en phase S et mesurer l’indice de la phase S ; II) identifier les noyaux en phase M et mesurer l’indice de la phase M ; III) déterminer si les noyaux étaient en phase S mitotique ou méiotique ; IV) mesure la durée du G2 ; V) mesure la duartion des phases G2 + M + G1 ; VI) mesure le taux d’entrée méiotique ; VII) estimer le taux de progression de la méiose.
On peut faire plusieurs mesures cycle cellulaire de seulement quelques types d’expériences de wet-lab. Le protocole ci-dessous décrit un étiquetage d’impulsion de 30 min en se nourrissant de c. elegans adultes hermaphrodites avec EdU étiqueté les bactéries et les cellules de phase M co marquage par coloration avec progénitrices et anticorps anti-pH3 cellules de la zone de coloration avec l’anticorps anti-WAPL-1. Seuls les changements dans la durée de l’Education se nourrissent (étape 2.5), type d’anticorps utilisé (étape 5), et analyses (étape 8.3) sont nécessaires pour les mesures supplémentaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Préparation de bactéries marquées EdU (étape 1) est essentielle à ce protocole et le premier point pour le dépannage. Étiquette de type sauvage jeunes adultes hermaphrodites très fiable dans un 4 h EdU-impulsion, ce qui en fait un contrôle utile pour chaque nouveau lot de bactéries marquées EdU. En outre, des bactéries intactes EdU marquées qui pénètrent dans l’intestin (chez les animaux âgés ou certains mutants défectueux du pharynx/rectifieuse) seront étiqueter avec la chimie de clic et apparaissen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants envers le centre de stock d’e. coli pour MG1693 ; Wormbase ; le centre de génétique de Caenorhabditis qui est financé par le National instituts de santé Bureau de recherche programmes d’Infrastructure (P40OD010440) pour les souches ; Zach Pincus pour conseils statistiques ; Aiping Feng pour réactifs ; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar et John Brenner pour formation, conseils, soutien et discussion utile ; et les labos Kornfeld et Schedl pour vos commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par le National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 à KK, R01 GM100756 à TS] et une bourse prédoctorale National Science Foundation [DGE-1143954 et DGE-1745038 à ZK]. Le National Institutes of Health, ni la National Science Foundation a eu aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte, l’analyse et l’interprétation des données, ni par écrit le manuscrit.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Referências
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