子宮内膜症の異種マウスモデルで病巣の大きさの非侵襲的モニタリング
Summary
ここでは、マウスに移植した蛍光に分類されたひと子宮内膜片のライブ イメージングのためのプロトコルを提案する.メソッドは、リアルタイムの蛍光レポーターによって放出される蛍光の定量化と監視によって子宮内膜症の病巣の大きさの選択の薬の影響を研究します。
Abstract
ここでは、子宮内膜症の進行を注入された異所性ひと子宮内膜組織によって放出される蛍光の非侵襲的モニタリングを通じてリアルタイムで評価される異種マウス モデルの実装のプロトコルについて述べる。このため、ひと子宮内膜の生検はドナー女性寄付継続的な卵から取得されます。ひと子宮内膜断片アデノ レポーター蛍光タンパク質 mCherry の cDNA を表現するために設計の前で培養されます。可視化、時に感染症はその後選ばれた受信者マウスに注入した後、蛍光の最適な速度と組織をラベル付けします。注入術前 1 週間は、受信者マウスが経時およびエストラジ オールのペレットは、生存と病変の成長を維持するために皮下配置されます。手術の日にマウスが麻酔をかけられたと腹膜キャビティ白線. (1.5 cm) の小さな切開を通してアクセス蛍光に分類されたインプラントが tweezed、簡単に接着剤に浸漬し、腹膜の層に接続されています。切開、縫合、動物と日のカップルのための回復します。臓インプラントによって放出される蛍光は通常非侵襲的インビボ イメージング システムと 4 週間毎の 3 日間が監視されます。臓インプラントのサイズの変化は、mCherry 信号と最大蛍光強度を示す初期の時点に対する正規化の数量化によるリアルタイムで推定できます。
子宮内膜症モデルの伝統的な臨床齧歯動物はリアルタイムで病変の非侵襲的モニタリングを許可しないが、むしろ終点で薬の効果の評価になります。このプロトコルは、リアルタイムで病変を追跡することができ、子宮内膜症モデルで臨床薬の治療の可能性を探索するより便利です。このように生成されたモデルの主な制限は、非侵襲的モニタリングが不可能である広告ウイルス episomal 式のための時間の長い期間にわたってです。
Introduction
子宮内膜症は、子宮腔外機能性子宮内膜の着床による慢性婦人科疾患です。異所性の病変は、成長し、慢性の骨盤の痛みや不妊症の1につながる炎症性プロセスを誘発します。10-15% の生殖年齢の女性には受けないこと endometriosis2、推定されている、不妊女性3の約 40-50% であります。子宮内膜症の現在の薬理学的治療法は病変を完全に根絶することができないと副作用4、5の自由ではないです。効率的な治療法の研究は人間の病変を適切にまねることができます、その化合物の他の中の病巣の大きさに及ぼす影響を密接に評価することができますこのような方法で子宮内膜症の既存の動物モデルの洗練が必要です。
打ち込むこと異所性病変の組織学的に同一と人間6,7,8; のように似たようなサイトでは、子宮内膜症を模倣する霊長類モデルを使用されています。ただし、倫理的な問題や高度の経済コストに関連する制限の霊長類での実験の使用9。その結果、子宮内膜症の生体モデルの実施のため特に齧歯動物、小動物の使用は、個人10,11の大きい数を用いる調査のためそれを支持する続けています。子宮内膜症によって誘導されうるこれらの動物の齧歯類子宮角 (「相同モデル」)12,13の部分または異所性サイト (異種モデル) ヒトの子宮内膜・子宮内膜症組織を移植14.人間と対照をなして齧歯動物は自分の子宮内膜組織を流したか、それにより子宮内膜症が開発されない自発的にこれらの種の。したがって、子宮内膜症のモデルと異所性マウス子宮組織を注入したという事実のために批判されている同種のマウスはひと子宮内膜症病変15の特性を反映しません。
子宮内膜症の適切な生理は、子宮内膜症免疫不全動物に新鮮なひと子宮内膜の断片を注入する、異種モデルでまねることができます。異種従来終了点では、興味の化合物の治療効果一般的ノギス16を使って病巣の大きさの評価によって評価されます。明白な制限など、エンドポイント動物モデルは許可されている注入ダイナミクスや時間の経過とともに子宮内膜症病変を勉強します。追加の制限は、キャリパーの使用は、病巣の大きさの正確な測定を許可しないことです。確かに、キャリパーによって提供される標準誤差は、サイズが実際の変化を検出するこれらのツールの容量を制限する、マウスに注入病変の大きさと同じ範囲 (ミリメートルなど) でです。
このような制限を克服するためにここで、我々 は移植人体組織が記者 m 桜の蛍光蛋白質を表現する設計は子宮内膜症の異種マウス モデルの生成をについて説明します。適切なイメージを用いた蛍光信号の検出は、リアルタイムでそのサイズの同時定量と病変の状態を非侵襲的監視できます。したがって、我々 のモデルは、病巣の大きさでより客観的、バリエーションの正確な推定を実行するリアルタイムの非侵襲的モニタリングの機会と可能性をもたらす、エンドポイントの従来モデルと比較して明確な利点を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに詳細なプロトコル記述する子宮内膜症の病変のアーキテクチャのアーキテクチャによって維持される放出される蛍光のリアルタイム評価を同時にできるようにしながら mCherry の動物モデルの実装子宮内膜組織をラベル付けします。このプロトコルでは特定のインビボ イメージング システムとラベルの病変によって放出される蛍光を非侵襲的評価に関連するソフトウェアの使用をにつ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はスペイン経済省ミゲル サーブレット プログラム [CP13/00077] (欧州地域開発基金) のフェダーによって共同設立を通じて競争力に支え、授与カルロス III 健康研究所助成金によってと同様、R をゴメス博士に授与Dr R をゴメス [PI14/00547 と PI17/02329] して教授 A. カノ [PI12/02582]。
Materials
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
Referências
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