Nettoyage catalytique de plante oxygénées espèces In Vivo par des nanoparticules d’oxyde de cérium anioniques
Summary
Nous présentons ici un protocole pour la synthèse et la caractérisation des nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) BR (espèces réactives de l’oxygène) nettoyage en vivo, nanoceria d’imagerie dans les tissus végétaux par microscopie confocale et in vivo surveillance de nanoceria ROS lessivage par microscopie confocale.
Abstract
Accumulation de réactives de l’oxygène (DRO) est une caractéristique de la réponse des plantes aux stress abiotiques. ROS jouer un double rôle chez les plantes en agissant comme des molécules à de faibles niveaux de signalisation et d’endommager les molécules à des niveaux élevés. Accumulation de ROS dans les plantes stressées peut endommager les métabolites, enzymes, les lipides et l’ADN, provoquant une diminution de la croissance des plantes et des rendements. La capacité des nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) pour piéger catalytiquement ROS en vivo fournit un outil unique pour comprendre et la tolérance au stress abiotique bioingénieur plante. Nous présentons ici un protocole pour synthétiser et caractériser les nanoceria enduit acide poly (acrylique) (PNC), interface des nanoparticules avec plantes par infiltration du limbe foliaire et surveiller leur distribution et ROS nettoyage in vivo à l’aide de confocal microscopie. Cours outils moléculaires pour manipuler les accumulation de ROS dans les plantes se limitent aux espèces modèles et nécessitent des méthodes de transformation laborieuse. Ce protocole pour in vivo ROS nettoyage a le potentiel pour être appliquée aux plantes de type sauvage avec des feuilles larges et structure de la feuille comme thaliana d’Arabidopsis.
Introduction
Nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) sont largement utilisés dans les organismes vivants, de la recherche fondamentale à la bio-ingénierie, en raison de leurs espèces distinctes catalytique réactives de l’oxygène (ROS) nettoyage capacité1,2,3. Nanoceria ai ROS nettoyage capacités en raison d’un grand nombre de places de surface d’oxygène qui alternent entre deux oxydation États (Ce3 + et Ce4 +) 4,5,6. Ce3 + ballants obligations piéger efficacement ROS, tandis que les souches de réseau à l’échelle nanométrique favoriser la régénération de ces sites de défaut via redox réactions7de cyclisme. Nanoceria ont également été récemment utilisé pour l’étude et ingénierie végétale fonction8,9. Plantes sous stress abiotique expérience accumulation de ROS, causant des dommages oxydatifs à lipides, protéines et ADN10. Chez les plantes Arabidopsis , nanoceria nettoyage catalytique des ROS dans vivo mène à la photosynthèse végétale améliorée sous forte luminosité, chaleur et froid souligne8. L’application nanoceria dans le sol aussi augmentations shoot de rendement biomasse et grain de blé (Triticum aestivum)11; des plants de canola (Brassica napus) traités par nanoceria ont une plus grande biomasse de plantes sous stress salin,12.
Nanoceria offrent des bioingénieurs et planter des biologistes un outil basés sur la nanotechnologie afin de comprendre les réactions au stress abiotique et améliorer la tolérance au stress abiotique plante. En vivo ROS nettoyage capacités de Nanoceria est indépendants des espèces de plantes, et la livraison facile dans les tissus de la plante a le potentiel pour permettre à une application générale en dehors des organismes modèles. Contrairement aux autres méthodes génétiquement, nanoceria ne nécessitent pas de générer les lignes de la plante avec la surexpression des enzymes antioxydantes supérieures br nettoyage capacité13. Infiltration de limbe foliaire de nanoceria aux plantes est une approche pratique pour la recherche en laboratoire.
L’objectif général du présent protocole est de décrire 1) la synthèse et la caractérisation de poly chargée négativement (acrylique) acide nanoceria (PNC), 2) la livraison et la suivi des PNC dans les cellules de la feuille et 3) le contrôle de PNC-activé ROS nettoyage en vivo. Dans ce protocole, poly chargée négativement (acrylique) acide nanoceria (PNC) sont synthétisés et caractérisés par leur spectre d’absorption, diamètre hydrodynamique et potentiel zêta. Nous décrivons une méthode d’infiltration lamina feuille simple pour livrer des PNC en usine de tissus foliaires. En vivo imagerie des nanoparticules de distribution dans les cellules du mésophylle, un colorant fluorescent (DiI) a été utilisé pour étiqueter les PNC (DiI-PNC) et observer les nanoparticules par microscopie confocal fluorescence. Enfin, nous expliquons comment surveiller en vivo PNC ROS fouillant dans la microscopie confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons les PNC synthèse, caractérisation, étiquetage de colorant fluorescent et imagerie confocale des nanoparticules dans les cellules du mésophylle plante à exposer leur en vivo ROS activité anti-radicalaire. PNC sont synthétisés à partir d’un mélange de nitrate de cérium et AAP solution hydroxyde d’ammonium. PNC sont caractérisés par la spectrophotomery de l’absorption et la concentration déterminée à l’aide de la Loi de Beer-Lambert. Mesures de potentiel z?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Université de Californie à Riverside et USDA National Institute of Food et Agriculture, Hatch projet 1009710 à J.P.G. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous Grant no 1817363 à J.P.G.
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
Referências
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