Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Summary

Camundongos geneticamente modificados são modelos úteis para investigar mecanismos de câncer de próstata. Aqui nós apresentamos um protocolo para identificar e dissecar os lobos da próstata de um sistema urogenital do rato, diferenciá-los com base em histologia e isolar e cultura primária de células da próstata em vitro como esferoides para análises a jusante.

Abstract

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) servem como modelos pré-clínicos eficazes para investigar a maioria dos tipos de cânceres humanos, incluindo o câncer de próstata (PCa). Compreender a anatomia e histologia da próstata do rato é importante para a utilização eficiente e adequada caracterização de tais modelos animais. A próstata de rato tem quatro pares distinto de lóbulos, cada um com características próprias. Este artigo demonstra o método apropriado de dissecação e identificação dos lobos da próstata do rato para análise da doença. Pós-dissecação, as células da próstata podem ser ainda mais cultivadas em vitro para compreensão mecanicista. Desde o rato próstata células primárias tendem a perder suas características normais quando cultivadas em vitro, nós esboçamos aqui um método para isolar as células e cultivá-las como culturas de esferoide 3D, que é eficaz para preservar o fisiológico características das células. Essas culturas 3D podem ser usadas para analisar a morfologia da célula e níveis de comportamento em condições fisiológicas perto, investigando alterado e localizações das principais proteínas e vias envolvidas no desenvolvimento e progressão de uma doença e olhando para respostas para tratamentos com drogas.

Introduction

A comunidade científica tem sido a tentativa de elucidar o mecanismo complexo de desenvolvimento de câncer humano há décadas. Considerando que a identificação de potenciais jogadores-chave e alvos de drogas começa com estudos de tecidos e células do pacientes, a aplicação translacional de tais achados, muitas vezes requer o uso de modelos animais pré-clínicos. O uso de camundongos geneticamente modificados modelos (GEMMs) para cânceres humanos modelo aumentou firmemente desde o estabelecimento do Mouse modelos de humano cancros consórcio (NIC-MMHCC), um comitê que procurava descrever e unificar as características de câncer rato modelos para os cientistas em todo o mundo^1,2. Modelos de mouse cumprir a necessidade de estudos mecanicistas em estudos pré-clínicos da maioria dos tipos de câncer, para compreender o desenvolvimento, a progressão, a resposta aos tratamentos e adquiriram resistência³.

Câncer de próstata é o câncer mais comumente ocorrem em homens, afetando mais de 160.000 homens cada ano⁴. Formas agressivas da doença reivindicam dezenas de milhares de vidas por ano. No entanto, o mecanismo de progressão da doença ainda seja mal compreendido. Isso resulta em uma séria falta de opções de tratamento eficaz para o cancro da próstata avançado e metastático, como evidenciado pela alta taxa de mortalidade em pacientes de câncer de próstata avançado⁴. Portanto, há uma necessidade crescente de modelos pré-clínicos estudar o câncer de próstata. No entanto, devido as diferenças inerentes entre o rato e a próstata humana, modelagem de câncer de próstata em GEMMs não ganhou popularidade até o sistema de classificação de Bar Harbor foi introduzido em 2004, que delineou as alterações histopatológicas no mouse próstata aquando da manipulação genética, identificação de alterações neoplásicas e sua relação com estágios de progressão de câncer em seres humanos⁵. Uma característica importante da próstata do rato que deve ser levada em consideração enquanto estudava qualquer modelo GEMM da próstata é a presença de quatro pares distinto dos lobos: anterior, lateral, ventral e dorsal. Os lóbulos apresentam diferenças significativas na histopatologia e gene expressão padrão⁶. Padrão de expressão de proteínas probasin pode variar entre lóbulos no jovem pós-puberdade ratos⁷, que deve ser considerado desde modelos baseados em Cre GEMM destinam-se principalmente usando um promotor baseada em probasin chamado Pb-Cre4⁷. As diferenças espaciais e temporais resultantes em Cre expressão muitas vezes levam a diferenças nos cronogramas de iniciação e progressão do tumor, bem como diferenças nas alterações neoplásicas entre os lóbulos. Portanto, é importante dar conta de tais diferenças, enquanto estudava o desenvolvimento do tumor na próstata GEMMs, e os lóbulos individuais podem precisar ser avaliado separadamente para obter resultados reprodutíveis. A primeira parte deste artigo descreve os métodos apropriados para dissecar uma próstata de rato, identificar e separar cada lóbulo e reconhecer as diferenças histológicas entre os lóbulos.

Enquanto a análise do crescimento do tumor e a histopatologia pode fornecer insights valiosos sobre o desenvolvimento do tumor, eles não fornecem muitas informações sobre mecanismos moleculares. Para estudar o mecanismo de desenvolvimento do tumor e progressão, muitas vezes é útil analisar o tumor de células in vitro. Vários métodos têm sido sugeridos ao longo dos anos que envolvem culturas destas células, incluindo culturas de suspensão, culturas 3D⁸ e recentemente, 2D regular culturas⁹. Considerando que a maioria desses métodos resulta em taxas de sobrevivência e proliferação de células boas, as culturas 3D fornecem um ambiente mais próximo de condições fisiológicas. Em 3D ou esferoide culturas cultivadas em uma membrana basal da matriz extracelular (ECM), as células totalmente diferenciadas luminal geralmente têm taxa de sobrevivência muito baixo; no entanto, as células basais e intermediárias (principalmente as células-tronco) são capazes de se propagar e produzir aglomerados de células chamados de esferoides¹⁰. Isso o torna adequado para um estudo de câncer desde cancros epiteliais acredita-se que se originam de células-tronco (popularmente conhecidas como câncer células-tronco)¹¹. A segunda parte do presente protocolo descreve um método para o cultivo de células da próstata do rato em culturas 3D. As esferas resultantes podem ser usadas para diversos tipos de análises a jusante, incluindo o estudo da morfologia de organoides e comportamento por célula viva da imagem latente, mancha de proteínas diferentes e o estudo de respostas para quimioterápicos tratamentos.

No geral, o objetivo do presente protocolo é delinear o ideais métodos para usar modelos de rato no cancro da próstata, descrevendo as técnicas de anatomia e dissecação da próstata do rato e o processamento do tecido para culturas de esferoide e análise em vitro .

Protocol

Todos os experimentos de rato aqui descritos foram realizados de acordo com as orientações descritas nos protocolos institucionais IACUC-aprovado na SUNY Upstate Medical University. 1. a dissecação do sistema Urogenital (UGS) Nota: O diagrama esquemático é apresentado na Figura 1. Eutanásia em 3 meses masculino C57BL/6 mouse usando o método de eutanásia por inalação de CO2 ou outra técnica aprovada.N…

Representative Results

Os lobos da próstata do rato podem ser identificados e dissecados usando suas localizações em relação as vesículas seminais e a uretra. A próstata do rato é composta de 4 pares de lobos localizada dorsalmente e ventralmente para as vesículas seminais e a uretra. Figura 4a e 4b (topo) mostram os pontos de vista dorsais e ventrais da próstata intacto, junto com as vesículas seminais e a uretra. Os painéis de fundo (<strong class="xf…

Discussion

Este artigo descreve os métodos para a dissecção da próstata do rato e identificação dos lobos individuais. Também descrito é o protocolo para cultivo de células da próstata de rato em uma cultura 3D para análise em vitro .

Um passo crítico no protocolo de dissecação é colheita o UGS todo fora o mouse (1) e separando os órgãos individuais sob um microscópio de dissecação. O tecido da próstata é muito pequeno e cercado pelo resto do UGS; assim, é praticamente imp…

Materials

Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C