Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen
Summary
Genetisch gemodificeerde muizen zijn nuttige modellen voor het onderzoek naar prostaatkanker mechanismen. Hier presenteren we een protocol om te identificeren en ontleden prostaat lobben van het urogenitaal systeem van een muis, onderscheiden van hen op basis van histologie, isoleren en cultuur de primaire prostaat cellen in vitro als spheroïden voor downstream analyses.
Abstract
Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) dienen als effectieve preklinische modellen voor het onderzoeken van de meeste soorten menselijke kankers, met inbegrip van prostaatkanker (PCa). Inzicht in de anatomie en de histologie van de muis prostaat is belangrijk voor het efficiënt gebruik en de juiste karakterisering van dergelijke dierlijke modellen. De muis prostaat heeft vier verschillende combinaties van de lobben, elk met hun eigen kenmerken. Dit artikel demonstreert de juiste methode van dissectie en identificatie van de prostaat lobben muis voor analyse van de ziekte. Na dissectie, de prostaat cellen kunnen verder worden gekweekt in vitro voor mechanistische begrip. Sinds de muis prostaat primaire cellen de neiging om te verliezen hun normale kenmerken wanneer gekweekt in vitro, duidelijk naar voren komt hier een methode voor het isoleren van de cellen en groeien ze als 3D sferoïde culturen, die is effectief voor het behoud van de fysiologische kenmerken van de cellen. Deze 3D culturen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de morfologie van de cel en gedrag in in de buurt van de fysiologische omstandigheden, onderzoeken gewijzigd niveaus en lokalisaties van belangrijke eiwitten en trajecten die betrokken zijn bij de ontwikkeling en de vooruitgang van een ziekte, en kijken Reacties op behandelingen van de drug.
Introduction
De wetenschappelijke gemeenschap heeft geprobeerd het ophelderen van het complex mechanisme van de ontwikkeling van de menselijke kanker voor decennia. Overwegende dat de identificatie van potentiële hoofdrolspelers en drug doelen begint met patiënt cellen en weefsel studies, vereist de translationeel toepassing van dergelijke bevindingen vaak het gebruik van preklinische diermodellen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen modellen (GEMMs) met model menselijke kanker is gestaag gestegen sinds de oprichting van de muis modellen van menselijke kankers Consortium (NCI-MMHCC), een comité dat getracht te beschrijven en verenigen van de kenmerken van de muis kanker modellen voor wetenschappers wereldwijd1,2. Muismodellen voldoen aan de behoefte voor mechanistische studies in pre-klinische studies van de meeste vormen van kanker, voor inzicht in de ontwikkeling, progressie, reactie op de behandelingen, en verworven weerstand3.
Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen, die meer dan 160.000 mannen elk jaar4. Agressieve vormen van de ziekte beweren tienduizenden levens per jaar. Echter, het mechanisme van de progressie van de ziekte is nog steeds slecht begrepen. Dit resulteert in een ernstig gebrek aan effectieve behandelingsopties voor geavanceerde en uitgezaaide prostaatkanker, zoals blijkt uit het hoge sterftecijfer in geavanceerde prostaatkanker patiënten4. Vandaar, is er een groeiende behoefte aan pre-klinische modellen om te studeren van prostaatkanker. Echter, als gevolg van de inherente verschillen tussen de muis en het menselijke prostaat, modellering van prostaatkanker bij GEMMs kreeg niet populariteit totdat het classificatiesysteem van Bar Harbor werd geïntroduceerd in 2004, die geschetst van histopathologische veranderingen in de muis prostaat bij genetische manipulatie, identificatie van neoplastische veranderingen en hun relatie tot de stadia van progressie van kanker in de mens5. Een belangrijk kenmerk van de muis prostaat, die moet worden meegenomen tijdens het bestuderen van ieder prostaat GEMM model is de aanwezigheid van vier verschillende combinaties van kwabben: anterieure, laterale ventrale en dorsale. De lobben vertonen aanzienlijke verschillen in de histopathologie en gen expressie patroon6. Probasin eiwit-expressiepatroon kan variëren tussen de lobben in jonge na puberteit muizen7, die moet worden beschouwd aangezien Cre gebaseerde GEMM modellen zijn meestal ontworpen met behulp van een probasin gebaseerde promotor genaamd Pb-Cre47. De resulterende ruimtelijke en temporele verschillen in Cre expressie vaak leiden tot verschillen in de tumor initiatie en progressie tijdlijnen evenals verschillen in neoplastische veranderingen tussen de lobben. Dus, het is belangrijk om goed voor dergelijke verschillen terwijl het bestuderen van de ontwikkeling van de tumor in de prostaat GEMMs, en de individuele lobben kunnen moeten afzonderlijk worden beoordeeld om reproduceerbare resultaten te bereiken. Het eerste deel van dit artikel beschrijft de juiste methoden ontleden een muis prostaat, identificeren en elke kwab scheiden en herkennen de histologische verschillen tussen de lobben.
Terwijl de analyse van tumorgroei en histopathologisch onderzoek waardevolle verwerven in de ontwikkeling van tumor inzicht kan, bieden ze niet veel informatie over moleculaire mechanismen. Het mechanisme van de ontwikkeling van de tumor en de progressie te studeren, is het vaak nuttig om te analyseren de tumor cellen in vitro. Verschillende methoden hebben gesuggereerd door de jaren heen waarbij culturen van deze cellen, met inbegrip van opschorting culturen, 3D culturen8 en onlangs, regelmatige 2D9culturen. Overwegende dat de meeste van deze methoden leiden tot goede cel overleving en proliferatie tarieven, bieden de 3D culturen een omgeving die zich het dichtst bij de fysiologische omstandigheden. In 3D of sferoïde culturen geteeld in een kelder membraan extracellulaire matrix (ECM), zijn de volledig gedifferentieerde luminal cellen meestal zeer laag overlevingspercentage; echter, de basale en tussenliggende cellen (voornamelijk stamcellen) kunnen uitdragen en produceren van cel clusters genaamd spheroïden10. Dit maakt het geschikt voor de studie van een kanker omdat epitheliale kankers worden verondersteld te zijn afkomstig uit de cellen van de stam (volksmond bekend als de cellen van de stam van kanker)11. Het tweede deel van dit protocol beschrijft een methode voor het kweken van de prostaat cellen van de muis in 3D culturen. De resulterende sferen kunnen worden gebruikt voor verschillende soorten downstream analyses, met inbegrip van de studie van de organoid morfologie en gedrag door levende cel imaging, immunofluorescentie kleuring voor verschillende eiwitten, en de studie van reacties op chemotherapeutische behandelingen.
Globaal, is het doel van dit protocol te schetsen van optimale methoden voor het gebruik van Muismodellen in prostaatkanker door het beschrijven van de anatomie en dissectie technieken van de prostaat van de muis en de verwerking van het weefsel voor sferoïde culturen en in vitro analyse .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit document schetst de methoden voor dissectie van de prostaat van de muis en de identificatie van individuele lobben. Ook beschreven is het protocol voor het kweken van de prostaat cellen van de muis in een 3D-cultuur voor in vitro analyse.
Een cruciale stap in het protocol van de dissectie is (1) oogsten het hele UGS uit de muis en het scheiden van de afzonderlijke organen onder een Microscoop dissectie. Het prostaat weefsel is zeer klein en omgeven door de rest van de UGS; Dus, he…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de subsidie van de National Cancer Institute, R01CA161018 naar LK.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
Referências
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Pesquisa do Câncer. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. . Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Pesquisa do Câncer. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Pesquisa do Câncer. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Pesquisa do Câncer. 70 (18), 7294-7303 (2010).
