O protocolo descrito aqui permite que pesquisadores especificamente modificar capsids adenovírus em locais seleccionados pela química simples. Adenovírus blindado vectores partículas e vetores de transferência do gene redirecionada podem ser gerados, e interações do anfitrião de vetor podem ser estudadas.
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Artigo de método
Combinação de modificações genéticas e químicas de capsídeos em vetores de transferência gênica baseados em adenovírus para blindagem e direcionamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vetores adenovírus são potentes ferramentas para virotherapy de vacinação e Oncolíticos genética. No entanto, eles são propensos a várias interações indesejáveis vetor-hospedeiro, especialmente após a entrega na vivo . É um consenso que as limitações impostas pela interação vetor-hospedeiro indesejado só podem ser superada se definidas modificações da superfície do vetor são executadas. Essas modificações incluem a blindagem das partículas de interações indesejadas e direcionamento pela introdução de novos ligantes. O objetivo do protocolo aqui apresentado é permitir que o leitor gerar protegido e, se desejado, redirecionados vetores de transferência de gene humano adenovírus ou vírus Oncolíticos. O protocolo permitirá que pesquisadores modificar a superfície do capsids do vetor de adenovírus pelo específico acessório químico de polímeros sintéticos, carboidratos, lipídios ou outras partes biológicas ou químicas. Descreve a tecnologia de ponta de modificações de capsídeo combinada de genética e química, que têm sido mostrados para facilitar a compreensão e superação das barreiras para entrega na vivo de vetores adenovírus. É fornecida uma descrição detalhada e comentada dos passos cruciais para a realização de reações químicas específicas com vírus biologicamente ativos ou vetores de vírus-derivado. A tecnologia descrita no protocolo baseia-se na introdução genética de cisteína (naturalmente ausente) resíduos em ciclos expostas ao solvente de vetores adenovírus-derivado. Estes resíduos de cisteína fornecem uma reatividade química específica que pode, após a produção dos vetores de altos títulos, ser explorada para altamente específico e eficiente acoplamento químico covalente de moléculas de uma grande variedade de classes de substância para o vetor partículas. Importante, este protocolo pode facilmente ser adaptado para executar uma ampla variedade de diferentes (não-tiol-baseado) as modificações químicas de capsids do vetor de adenovírus. Finalmente, é provável que esse vetores de transferência do gene de baseados em vírus não-envelopado além de adenovírus podem ser modificadas desde a base do presente protocolo.
Introdução
Adenovírus (Ad), membros da família Adenoviridae, são vírus de DNA não-envelope de que mais de 70 tipos até agora têm sido identificadas (http://hadvwg.gmu.edu). Dependendo hemaglutination Propriedades, estrutura do genoma e resultados de sequenciamento, os tipos de 70 Ad podem ser divididos em sete espécies (adenovírus humano À G)1,2. Genoma humano Ad é 38 kb em tamanho e encapsulado por um nucleocapsídeo icosahedral3. Devido à sua abundância, o hexon de proteínas do capsídeo, penton base e fibra são todos referidos como proteínas do capsídeo principais. O mais abundante e a maior hexo....
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Protocolo
Nota: em seguida, um protocolo para PEGylation geneti-química de um anúncio de vetor é descrito com detalhe. Para habilitar o acoplamento específico da fracção de PEG, um vetor Ad5 previamente foi geneticamente modificado por introduzir um resíduo de cisteína da proteína hexon no loop hipervariável 5 conforme descrito na publicação anterior36e um PEG maleimide-ativado composto é usado como composto de acoplamento.
1. preparação de Buffers para a purificação de vetor por gradientes de CsCL passo
- Preparar 400 mL de tampão de adenovírus (Ad-tampão) adicionando HEPES (4,76 g/400 mL) de 50 mM e 150 mM de NaCl (3....
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Resultados
A Figura 2 mostra exemplos do efeito citopático (CPE) em 293 células (HEK 293) que indica a produção bem sucedida do vetor. As células devem mostrar morfologia (Figura 2) 40-48 horas após a inoculação com o vetor de vírus. O Commit certo para a colheita é crucial para não perder as partículas do vírus por lise celular e impedindo a oxidação dos grupos tiol geneticamente introduzido. Se partículas de vetor são liberadas no meio po.......
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Discussão
A eficiência, pelo qual as cisteínas geneticamente introduzidas podem ser quimicamente modificadas normalmente é 80-99%, e certas variáveis influenciam essa eficiência. Em primeiro lugar, é fundamental que as cisteínas geneticamente introduzidas não sofrem oxidação prematura. Apesar de ser bem protegida no ambiente de redução das células de produtor, é obrigatório para fornecer um ambiente não-oxidativo após liberar partículas de vetor de células o produtor e durante a modificação química. Para este fim, reduzir os reage.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Purificação de vetores e modificação química | |||
| Gás argônio | Air liquide | revendedor de gás | |
| Nitrogênio líquido | Air liquide | revendedor de gás | |
| Tubos de centrífuga de 500 mL | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0,22 µ m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (seringas) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Agulhas Fine-Ject para uso único (amarelo 0,9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Cloreto de césio 99,999% Ultra Qualidade | Roth | 8627.1 | |
| Grânulos de gel de sílica | Applichem | A4569.2500 | |
| Metoxipolietilenoglicol maleimida - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | armazena em grânulos de gel de sílica a -80 ° C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | aberto apenas no capô |
| Coluna de cromatografia de exclusão de tamanho PD-10 | GE Healthcare | 17-0851-01 | loja em 4 ° C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Nome< | strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Material para cultura de células< / forte > | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Tripsina / EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicilina / Estreptomicina | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Pontas de filtro da biosfera (vários tamanhos) | Sarstedt | ||
| (vários tamanhos) | Sarstedt | ||
| (vários tamanhos) | Placas Sarstedt | ||
| TC 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Material para protocolo de coloração de prata | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Absoluto Etanol | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Ácido Acético | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldeído 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Etanol absoluto | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Tiossulfato de sódio | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Nitrato de prata | AppliChem | A3944.0025 | |
| Carbonato de sódio | AppliChem | A3900,0500 | |
| Nome | Empresa< | strong>Número de catálogo | Comentários< |
| strong>Special Lab Equipment | |||
| Dessecador | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter para Megafuge TX750 + Adaptador e Litros para tubos de 500 mL Banho-maria | |||
| Ultracentrífuga Convencional | |||
| e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| Rotor Ultrazentrifuge adequado por exemplo, SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Suporte Convencional | ||
| com pinças | Convencional | ||
| Lâmpada de pescoço de ganso | Convencional | ||
| convencional | bloco térmico | ||
| convencional | do rotor da sobre-cabeça | ||
| (OD 260) | Convencional |
Referências
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G.
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Reimpressões e permissões
