Gecombineerde genetische en chemische Eiwitmantel wijzigingen van genenoverdracht Adenovirus gebaseerde vectoren voor afscherming en Targeting
Summary
Het protocol hier beschreven kan onderzoekers specifiek adenovirus capsids op geselecteerde locaties wijzigen door eenvoudige chemie. Afgeschermde adenovirus vectoren deeltjes retargeted gene transfer vectoren kunnen worden gegenereerd en vector-gastheer interacties kunnen worden bestudeerd.
Abstract
Adenovirus vectoren zijn krachtige hulpmiddelen voor genetische vaccinatie en oncolytische een. Nochtans, zijn zij gevoelig voor meerdere ongewenste vector-gastheer interacties, vooral na in vivo levering. Het is een consensus dat de beperkingen opgelegd door ongewenste vector-gastheer interacties kunnen alleen worden overwonnen als gedefinieerde wijzigingen van het oppervlak van de vector worden uitgevoerd. Deze wijzigingen omvatten afscherming van de deeltjes van ongewenste interacties en gericht op de invoering van nieuwe liganden. Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om de lezer te genereren afgeschermd en, indien gewenst, retargeted menselijke adenovirus gene transfer vectoren of oncolytische virussen. Het protocol kunnen onderzoekers het wijzigen van het oppervlak van een adenovirus vector capsids door specifieke chemische bevestiging van synthetische polymeren, koolhydraten, lipiden of andere biologische of chemische wordt. Het beschrijft de cutting-edge technologie van wijzigingen van de gecombineerde genetische en chemische Eiwitmantel, die is gebleken om het begrip en het overwinnen van belemmeringen voor in vivo levering van adenovirus vectoren. Een gedetailleerde en becommentarieerde beschrijving van de essentiële stappen voor het uitvoeren van specifieke chemische reacties met biologisch actieve virussen of virus afkomstige vectoren is gegeven. De technologie wordt beschreven in het protocol is gebaseerd op de genetische invoering van (natuurlijk afwezig) cysteïne residuen in oplosmiddel-blootgesteld lusjes van adenovirus afkomstige vectoren. Deze residuen van cysteïne bieden een specifieke chemische reactiviteit die na de productie van de vectoren aan hoge titers voor zeer specifieke en efficiënte covalente chemische koppeling van moleculen van een breed scala aan stof klassen naar de vector kan worden benut deeltjes. Nog belangrijker is, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor het uitvoeren van een breed scala aan verschillende (niet thiol-gebaseerde) chemische wijzigingen van adenovirus vector capsids. Tot slot, het is waarschijnlijk dat niet-gehuld virus gebaseerde gene transfer vectoren andere dan adenovirus kan worden gewijzigd vanuit de basis van dit protocol.
Introduction
Adenovirussen (Ad), leden van de familie adenovirussen, zijn niet-gehuld DNA-virussen die meer dan 70 soorten hebben tot dusver geïdentificeerd (http://hadvwg.gmu.edu). Afhankelijk van de hemaglutination eigenschappen, genoom structuur en volgorde resultaten, kunnen de 70 advertentietypen worden onderverdeeld in zeven soorten (menselijke adenovirussen A tot G)1,2. Het menselijk genoom van de advertentie is 38 kb in grootte en ingekapseld door een icosahedrale nucleocapside-3. Wegens hun overvloed, worden de Eiwitmantel eiwit hexon penton base en de vezels allemaal aangeduid als grote Eiwitmantel eiwitten. De meest overvloedige en grootste Eiwitmantel eiwit hexon vormt 20 Eiwitmantel facetten, elk bestaande uit 12 hexon homotrimers4,5. Penton, gelegen aan elke icosahedrale rand (vertex), bestaat uit pentamers voor een penton base en vertegenwoordigt de basis voor de Prikker hoekpunt dat is gebouwd van geglycosyleerde vezel trimeren5,6. De inheemse Ad cel invoeren bestaat in principe uit twee hoofdstappen. Eerst bindt de knop vezel aan de primaire receptor. In advertentietypen van soorten A, C, E en F is dit de coxsackie en adenovirus receptor (CAR). Deze interactie brengt het virion in ruimtelijke nabijheid van het celoppervlak, teneinde interacties tussen cellulaire verschijnsel en RGD-motief in de penton basis en bijgevolg inducerend cellulaire reacties. Ten tweede, veranderingen in het cytoskelet leiden tot internalisering van het virion en het transport naar de endosome7. Bij gedeeltelijke demontage in de endosome, het virion wordt vrijgegeven naar het cytoplasma und uiteindelijk reist naar de kern voor replicatie.
Terwijl Ad kan lokaal worden afgeleverd (bv., voor genetische vaccinatie), systemische levering via de bloedbaan zoals vereist voor het onco-een geconfronteerd met verschillende belemmeringen. Terwijl die in de bloedbaan circuleren, tegenkomen ingespoten virionen het verdedigingssysteem van immuunsysteem van de gastheer, leidt tot snelle neutralisatie van de vectoren virus gebaseerde en rendering van vectoren gebaseerde Ad uiterst inefficiënt in systemische toepassingen. Bovendien is de natuurlijke hepatotropism van Ad interfereert met systemische levering en Ad omleiden naar haar nieuwe doelcellen moet worden opgelost.
Germline-gecodeerde natuurlijke IgM antilichamen van het aangeboren immuunsysteem snel herkennen en zeer repetitieve structuren te binden op het oppervlak van het virion8,9. Deze immuuncomplexen activeren dan de klassieke en niet-klassieke routes van het complementsysteem, wat leidt tot snelle aanvulling-bemiddelde neutralisatie van een groot deel van de virionen8. Een tweede weg, wat resulteert in grote verwijdering van Ad virionen is bemiddeld door macrofagen,10 en gekoppeld aan acuut toxisch en hemodynamische bijwerkingen11,12. In het geval van Ad in het bijzonder elimineren Kupffer cellen die woonachtig zijn in de lever bindt aan en phagocytically nemen de Ad virionen via specifieke scavenger receptoren, waardoor hen uit het bloed13,14,15 . Specifieke scavenger receptoren zijn ook geïdentificeerd op sinusvormige endotheliale cellen van de lever (LSE cellen)16, en LSE cellen lijken ook om bij te dragen aan vector eliminatie17, maar aan in welke mate moet nog worden verduidelijkt. Bovendien, sommige advertentietypen en hun afgeleide vectoren zijn efficiënt afgezonderd door menselijke erytrocyten18 waarnaar zij via auto of de aanvulling receptor CR119 binden. Van de nota, dit sequestering mechanisme kan niet worden bestudeerd in de muis modelsysteem zoals contrast en menselijke erythrocyten, muis erytrocyten doen niet auto express.
Specifieke anti-Ad antilichamen gegenereerd door het adaptieve immuunsysteem na blootstelling aan Ad hetzij als gevolg van eerdere infecties met Ad of na de eerste levering in systemische toepassingen verhogen een verdere belemmering voor effectief gebruik van Ad vectoren, en zij moeten worden omzeild in efficiënte systemische levering.
Tot slot, de sterke hepatotropism van sommige advertentietypen (inclusief Ad5) ernstig belemmert toepassing van Ad in systemische therapie. Dit resulteert in hepatocyte transductie tropisme is te wijten aan de hoge affiniteit van het virion Ad aan bloed stollingsfactor X (FX), gemedieerd door de interactie van FX met de Ad hexon eiwit20,21,22. FX overbrugt het virion aan heparine sulfaat glycanen (HSPGs) op het oppervlak van hepatocyten20,23,24,25. Een cruciale factor voor deze interactie lijkt te zijn van de specifieke omvang van N – en O-sulfation van de HSPGs in cellen van de lever24, die verschilt van HSPGs op andere celtypes. Naast dit FX-gemedieerde traject suggereren recente studies verdere trajecten nog niet geïdentificeerd die resulteren in Ad transductie van hepatocyten26,27,28.
Onlangs, het heeft aangetoond dat FX niet alleen bij hepatocyte transductie van Ad betrokken is, maar ook door bindende, het virion het virus deeltje tegen neutralisatie beschermt door de aanvulling systeem26. Vermindering van de hepatocyte transductie doordat FX bindende, daarom zou maken het ongewenste neveneffect van toenemende Ad neutralisatie via het aangeboren immuunsysteem.
Een grondige kennis van de complexe interacties tussen vectoren en gastheerorganismen daarom moeten ontwikkelen van efficiëntere vectoren voor systemische toepassingen die het omzeilen van de belemmeringen van de host organisme oplegt.
Een strategie die oorspronkelijk werd gebruikt voor therapeutische proteïnen is aangepast voor Ad vectoren om op zijn minst gedeeltelijk de hierboven beschreven belemmeringen zijn. Antigenicity en immunogeniciteit van therapeutische eiwitten verbindingen kunnen worden verminderd door te koppelen aan polyethyleenglycol (PEG)29,30. Vandaar, de covalente koppeling van polymeren zoals PEG of poly [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) naar de Eiwitmantel oppervlak beschermt de vector van ongewenste vector-gastheer interacties. Algemeen, richt polymeer koppeling ε-amine groepen uit lysine kant residuen die zijn willekeurig verspreid op het oppervlak Eiwitmantel. Vector deeltjes in oplossing zijn, het hydrofiele karakter van de bijgevoegde polymeren, omringd door een stabiele water-shell die het risico van immuun cel erkenning of enzymatische degradatie vermindert. Bovendien bleken gepegyleerde Ad vectoren te onttrekken aan neutralisatie door anti-hexon antilichamen in vitro en in pre geïmmuniseerde muizen in vivo31. In tegenstelling tot genetische Eiwitmantel wijzigingen, wordt chemische koppeling van polymeren uitgevoerd na de productie en zuivering, waardoor niet alleen voor het gebruik van conventionele producent cellen en productie van hoge titer vector bestanden, maar ook voor gelijktijdige wijziging van duizenden aminozuren aan het oppervlak Eiwitmantel. Echter, amine geleide afscherming gebeurt willekeurig gedurende de hele Eiwitmantel oppervlakte, wat resulteert in hoge heterogeniteiten en niet toe te staan voor wijziging van specifieke capsomers. Bovendien schaden de grote polymeer wordt vereist voor gunstige effecten virus topicale32.
Het overwinnen van deze beperkingen, de Kreppel et al. 33 introduceerde het concept van een genetischgemodificeerdeorganismen-chemische voor vector re – en -targeting. Cysteines werden genetisch binnengebracht op het virus Eiwitmantel op oplosmiddel-blootgesteld zoals vezel HI-lus33, eiwit IX34en hexon35,36posities. Hoewel niet natuurlijk voorkomende, cysteïne-bevattende Ad vectoren kunnen worden geproduceerd op hoge titers in cellen van normale producent. Belangrijker, zorgt invoeging van cysteines in bepaalde capsomers en in verschillende posities binnen een enkele capsomer voor zeer specifieke wijzigingen van thiol groep-reactieve wordt. Deze aanpak van genetischgemodificeerdeorganismen-chemische heeft aangetoond dat overwonnen tal van obstakels in het ontwerp van de vector van Ad. De combinatie van amine gebaseerde PEGylation voor detargeting en thiol gebaseerde koppeling van transferrine aan de knop van de vezel die Hi-lus is bewezen om succesvol retarget gewijzigd Ad vectoren auto-deficiënte cellen33. Aangezien hexon betrokken is bij de meest ongewenste interacties (neutraliserende antilichamen, bloed stollingsfactor FX), werden thiol gebaseerde wijziging strategieën ook toegepast op hexon. Kleine PEG wordt koppelen aan HVR5 van hexon voorkomen Ad vector deeltjes te transduce SKOV-3 cellen in aanwezigheid van FX, overwegende dat grote PEG wordt verhoogd hepatocyte transductie14,35. AD vector deeltjes uitvoering van mutaties in de knop van de vezel remming van auto bindende en HVR7 remmende binding van FX (en lager ingevoegd cysteines in HVR1 voor positie-specifieke PEGylation) bleken te onttrekken aan antilichaam – en aanvulling-bemiddelde neutralisatie, evenals scavenger receptor-gemedieerde opname zonder verlies van infectiviteit. Interessant, ondanks een gebrek aan het natuurlijke FX-schild verbeterd PEGylation opnieuw transductie van hepatocyten als een functie van PEG size36. Echter werd aangetoond dat covalente afscherming een impact op intracellulaire mensenhandel processen heeft. Pril et al. ten opzichte van onomkeerbare versus bioresponsive shields op basis van pHPMA en aangetoond dat noch de modus afscherming noch co-polymeer kosteloos een impact gehad op cel invoeren maar beïnvloedde deeltje mensenhandel aan de kern. Dienst van een bioresponsive schild met positief geladen pHPMA co polymeren waarbinnen deeltje mensenhandel aan de kern, handhaving van de efficiëntie van de hoge transductie van Ad vectoren in vitro pt in vivo37.
Kortom, deze gegevens wijzen erop dat, zelfs in de veronderstelling dat alle vector-gastheer-interacties waren bekend en overwogen, buitensporige Eiwitmantel oppervlakte wijzigingen nodig zijn om te overwinnen van de hindernissen systemische vector levering is gekoppeld.
Hier bieden we een protocol voor het uitvoeren van specifieke chemische wijzigingen van adenovirus vector capsids voor afscherming en/of kredietherschikking van adenovirus vector deeltjes en adenovirus gebaseerde oncolytische virussen. Het concept van deze technologie is uiteengezet in Figuur 1. Het staat de afscherming van bepaalde regio’s van Eiwitmantel van ongewenste interacties door covalente gehechtheid van synthetische polymeren. Tegelijkertijd biedt het ook een middel om te hechten liganden en combineren van afscherming en targeting. Met behulp van eenvoudige chemie, zal onderzoekers zitten kundig voor covalent wijzigen adenovirus vector oppervlak met een breed scala aan moleculen met inbegrip van peptiden/eiwitten, koolhydraten, lipiden en andere kleine moleculen. Het protocol biedt bovendien een algemeen concept voor de chemische modificatie van biologisch actieve virus afkomstige vectoren onder handhaving van hun biologische integriteit en activiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
De efficiëntie waarmee de genetisch geïntroduceerde cysteines kunnen chemisch worden gewijzigd is meestal 80-99%, en bepaalde variabelen beïnvloeden deze efficiëntie. In de eerste plaats is het essentieel dat de genetisch geïntroduceerde cysteines geen voortijdige oxidatie ondergaan. Terwijl ze goed beschermd in het reducerende milieu van de cellen van de producent, is het verplicht om een niet-oxiderende milieu na het loslaten van deeltjes van de vector uit de cellen van de producent en tijdens chemische modificati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
Referências
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O’Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -. M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
