Combinado de modificaciones genéticas y químicas cápside de vectores basados en Adenovirus la transferencia de genes para blindar y dirigidos a
Summary
El protocolo aquí descrito permite a los investigadores modificar específicamente cápsida de adenovirus en sitios seleccionados por simple química. Blindado adenovirus vectores partículas pueden generarse vectores de transferencia génica versión y vector host interacciones pueden ser estudiadas.
Abstract
Vectores de adenovirus son herramientas potentes para genética vacuna y oncolíticos viroterapia. Sin embargo, son propensos a múltiples interacciones host vectores indeseados, especialmente después de la entrega en vivo . Es un consenso que las limitaciones impuestas por las interacciones indeseadas vector-host sólo pueden superarse si se realizan modificaciones definidas de la superficie del vector. Estas modificaciones incluyen protección de las partículas de las interacciones no deseadas y dirigidas a la introducción de nuevos ligandos. El objetivo del protocolo presentado aquí es que el lector generar blindado y, si lo desea, reorientarse vectores de transferencia génica humana adenovirus o virus oncolíticos. El protocolo permitirá a los investigadores modificar la superficie de la cápsida de vector de adenovirus por fijación química específica de polímeros sintéticos, carbohidratos, lípidos y otras moléculas biológicas o químicas. Describe la tecnología de vanguardia de modificaciones de la cápside genética y química combinada, que se han demostrado para facilitar la comprensión y superación de barreras para la entrega en vivo de los vectores de adenovirus. Se proporciona una descripción detallada y comentada de los pasos cruciales para llevar a cabo las reacciones químicas específicas con virus biológicamente activos o vectores derivados de virus. La tecnología descrita en el protocolo se basa en la introducción genética de cisteína (naturalmente ausente) residuos en lazos expuestos al solvente de vectores derivados de adenovirus. Estos residuos de cisteína proporcionan una reactividad química específica que puede, después de la producción de los vectores a altos títulos, ser explotada para el acoplamiento químico covalente altamente específico y eficiente de moléculas de una amplia variedad de clases de la sustancia al vector partículas. Lo importante, este protocolo se puede adaptar fácilmente para llevar a cabo una amplia variedad de diferentes modificaciones químicas (no basado en tiol) de cápsida de vector de adenovirus. Por último, es probable vectores de transferencia del gene de basada en virus no-envueltos que adenovirus pueden ser modificado de la base de este protocolo.
Introduction
Adenovirus (Ad), miembros de la familia Adenoviridae, son virus no-envueltos de ADN de los tipos más de 70 hasta ahora han sido identificados (http://hadvwg.gmu.edu). Según hemaglutination propiedades, estructura del genoma y resultados de la secuenciación, los tipos de 70 D.c. pueden dividirse en siete especies (adenovirus humano A G)1,2. El genoma humano de Ad es de 38 kb en tamaño y encapsulado por una nucleocápside icosaédrica3. Debido a su abundancia, el capsid proteína hexon, base del penton y fibra se todos conocen como proteínas de la cápsida principales. El más abundante y más grande capsid proteína hexon forma 20 facetas de cápside, cada uno con 12 del hexon homotrimers4,5. Penton, situado en cada borde icosaédrica (vértice), consiste en pentámeros de una base del penton y representa la base para el punto de vértice que está construido de fibra de glicosilada trimers5,6. La entrada de células nativa de Ad se compone básicamente de dos pasos principales. En primer lugar, la perilla de la fibra se une al receptor primario. Tipos de anuncios de las especies A, C, E y F, es el receptor coxsackie y adenovirus (coche). Esta interacción trae el virión en proximidad espacial de la superficie celular, facilitando así las interacciones entre las integrinas celulares y RGD motivo en la base del penton y consecuentemente inducir respuestas celulares. En segundo lugar, cambios en el citoesqueleto de llevan a la internalización del virión y transporte al endosome7. Sobre desmontaje parcial en el endosome, el virión se libera al citoplasma y en última instancia viaja al núcleo para la replicación.
Mientras que el anuncio puede entregarse localmente (ej., para la vacunación genética), entrega sistémica por el torrente sanguíneo como para onco-viroterapia enfrenta a varios obstáculos. Mientras circulan en el torrente sanguíneo, viriones inyectados encontrarán el sistema de defensa del sistema inmunitario del hospedador hacia la neutralización rápida de los vectores basados en virus y representación vectores basados en Ad extremadamente ineficiente en aplicaciones sistémicas. Además, la natural hepatotropismo de Ad interfiere con entrega sistémica y debe resolverse en redirigir anuncio sus nuevas células blanco.
Codificado del germline natural IgM anticuerpos del sistema inmune innato rápidamente reconocen y enlazar las estructuras altamente repetitivas en la superficie del virión8,9. Estos complejos inmunes luego activan las vías clásicas y no clásica del sistema del complemento, conduciendo a neutralización rápida mediada por el complemento de una gran parte de los viriones8. Una segunda vía dando lugar a mayor eliminación de virions Ad es mediada por macrófagos10 y asociada con aguda tóxica y hemodinámicos efectos secundarios11,12. En el caso de anuncio en particular, Kupffer células residentes en el hígado se unen a y phagocytically toman el anuncio viriones a través de limpiador específico receptores de tal modo eliminándolos de la sangre13,14,15 . También se han identificado receptores scavenger específicos en las células endoteliales sinusoidales hígado (células LSE)16, y LSE células también parecen contribuir al vector eliminación17, sino en qué medida necesita aclaración. Además, algunos tipos de anuncios y sus vectores derivadas son eficientemente secuestrados por eritrocitos humanos18 al que se unen mediante coche o el receptor del complemento CR119. De nota, este mecanismo de secuestro no puede ser estudiado en el sistema de modelo de ratón como en contraste con los eritrocitos humanos, eritrocitos de ratón no expresan el coche.
Anticuerpos específicos anti-anuncios generados por el sistema inmune adaptativo después de la exposición al anuncio debido a infecciones anteriores con Ad o después de la primera entrega en aplicaciones sistémicas levantar una barrera adicional al uso eficaz de los vectores de Ad, y deben ser evadidos en entrega sistémica eficiente.
Por último, el fuerte hepatotropismo de algunos tipos de anuncios (incluyendo Ad5) seriamente dificulta la aplicación de Ad en la terapia sistémica. Este tropismo resultando en la transducción de hepatocitos es debido a la alta afinidad del virión Ad para el factor de la coagulación de sangre X (FX), mediada por la interacción de la FX con el anuncio del hexon proteína20,21,22. FX puentes el virión a glicanos de sulfato de heparina (HSPGs) en la superficie de hepatocitos20,23,24,25. Un factor crucial para esta interacción parece ser la medida específica de N – y O-sulfatación de HSPGs en24de las células del hígado, que es distinto de HSPGs en otros tipos celulares. Además de esta vía mediada por FX, estudios recientes sugieren otras vías aún no identificaron que resultan en la transducción de anuncio de hepatocitos26,27,28.
Recientemente, se ha demostrado que FX no sólo participa en la transducción de hepatocitos de Ad, pero también por enlace, el virión protege la partícula de virus contra la neutralización por el sistema de complemento26. Reducción de transducción del hepatocito por prevención de atascamiento de FX, por lo tanto, crearía el efecto secundario indeseado de aumentar Ad neutralización por el sistema inmune innato.
Un conocimiento profundo de las complejas interacciones entre los vectores y los organismos de acogida por lo tanto es necesario desarrollar vectores más eficientes para aplicaciones sistémicas que eluden las trabas impuestas por el organismo del anfitrión.
Una estrategia que ha utilizado originalmente para proteínas terapéuticas ha sido adaptada para vectores de anuncio por lo menos parcialmente superar las barreras descritas arriba. Antigenicidad y la inmunogenicidad de la proteína terapéutica compuestos podrían reducirse por acoplamiento al polietilenglicol (PEG)29,30. Por lo tanto, el acoplamiento covalente de polímeros tales como PEG o poli [N-(2-hidroxipropil) methacrylamid] (pHPMA) a la cápside superficie protege el vector de las interacciones host vector no deseados. Comúnmente, acoplamiento de polímero está dirigido a grupos ε-amino de residuos de lado de lisina que se distribuyen al azar en la superficie de la cápside. Las partículas vectoriales en la solución, debido a la naturaleza hidrofílica de los polímeros adjuntos, rodeadas de una concha de agua estable que reduce el riesgo de reconocimiento de células inmunitarias o degradación enzimática. Por otra parte, vectores pegilado Ad fueron demostrados para evadir la neutralización por anticuerpos anti hexon en vitro y en ratones previamente inmunizados en vivo31. En contraste con modificaciones genéticas de la cápside, acoplamiento químico de polímeros se realiza después de la producción y purificación, lo que permite no sólo para el uso de células productora convencional y la producción de las poblaciones de vectores de alto título, sino también para simultánea modificación de miles de aminoácidos en la superficie de la cápside. Sin embargo, dirigido por amina blindaje se produce al azar a lo largo de la superficie de la cápside entero, dando por resultado alta heterogeneidades y no permitiendo modificación de capsómeros específicos. Además, las moléculas de polímero grande para efectos beneficiosos afectan virus bioactividad32.
Para superar estas limitaciones, Kreppel et al. 33 introdujo un concepto de geneti-química de vectores re – y la focalización. Cisteínas genéticamente fueron introducidos en la cápside del virus en las posiciones expuestas al solvente como fibra HI-lazo33, proteína IX34y del hexon35,36. Aunque pueden producir vectores de Ad no natural, rodamiento de cisteína en altos títulos en las células normales del productor. Lo importante, inserción de cisteínas en algunos capsómeros y en distintas posiciones dentro de un capsómero solo permite modificaciones muy específicas de moléculas reactivas con el grupo tiol. Este enfoque geneti-química se ha demostrado para superar numerosos obstáculos en el diseño vectorial. La combinación de la pegilación base de aminas para desapuntar y acoplamiento tiol-basado de la transferrina a la perilla de fibra que HI-lazo ha sido probado con éxito Demons modificación vectores anuncio coche deficientes las células33. Dado que hexon participa en interacciones más indeseadas (neutralización de anticuerpos, factor de coagulación de sangre FX), estrategias de modificación de tiol-basado también se aplicaron a hexon. Acoplamiento de pequeñas moléculas de PEG al HVR5 del hexon prevenir partículas de vector Ad para transducir las células SKOV-3 en presencia de FX, mientras que grandes partes de PEG aumentaron hepatocito transducción14,35. Partículas de vector ad llevar mutaciones en la perilla de fibra inhibe la Unión del coche y el HVR7 inhibe Unión de FX (cisteínas rodamiento insertado en HVR1 para posición específica la pegilación) fueron demostradas para evadir la neutralización mediada por anticuerpos y complemento, así como scavenger receptor-medió la absorción sin pérdida de infectividad. Curiosamente, a pesar de la falta del escudo natural de FX, la pegilación nuevamente mejorado transducción de hepatocitos como una función de PEG tamaño36. Sin embargo, fue demostrado que blindar covalentes tienen un impacto en los procesos de tráfico intracelulares. Mero et al. en comparación con irreversible frente a escudos de bioresponsive basado en pHPMA y demostró que ni el modo de carga de protección ni de copolímero tuvo un impacto en la entrada de la célula pero afectó tráfico de partículas en el núcleo. Empleo de un escudo bioresponsive con carga positiva pHPMA copolímeros permitidos para el tráfico de partículas en el núcleo, manteniendo la eficiencia de transducción alta de anuncio vectores in vitro e in vivo37.
En Resumen, estos datos indican que, incluso bajo el supuesto de que todo vector-host-interacciones fueron conocidas y consideradas, cápside excesiva superficie modificaciones son necesarias para superar los obstáculos asociados con la entrega sistémica de vector.
Aquí proporcionamos un protocolo para realizar modificaciones químicas específicas de cápsida de vector de adenovirus para blindar o retargeting de partículas de vector de adenovirus y virus basados en adenovirus oncolíticos. El concepto de esta tecnología se describe en la figura 1. Permite la protección de ciertas regiones de la cápside de interacciones no deseadas por el accesorio covalente de polímeros sintéticos. Al mismo, también proporciona un medio para fijar ligandos y combinar protección y orientación. Usando la simple química, experimentadores podrá modificar covalentemente superficie de vectores de adenovirus con una gran variedad de moléculas incluyendo péptidos/proteínas, carbohidratos, lípidos y otras moléculas pequeñas. Además, el protocolo proporciona un concepto general para la modificación química de vectores derivados de virus biológicamente activos en el mantenimiento de su integridad biológica y la actividad.
Protocol
Representative Results
Discussion
La eficiencia por el cual las cisteínas genéticamente introducidas pueden ser modificados químicamente es típicamente 80-99%, y ciertas variables influyen en dicha eficacia. En primer lugar, es primordial que las cisteínas genéticamente introducidas no sufren oxidación prematura. Estando bien protegido en el ambiente reductor de las células del productor, es obligatorio proporcionar un ambiente no-oxidative después de lanzar vector partículas de las células del productor y en la modificación química. Para el…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
Referências
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