التصور في الوقت الحقيقي وتحليل للإصابة تشوندروسيتي بسبب تحميل الميكانيكية في Explants الغضاريف موريني سليمة تماما
Summary
نحن نقدم طريقة لتقييم مدى الضرر/موت الخلايا على السطح المفصلي للمفاصل مورين سليمة المكانية بعد تطبيق الأحمال الميكانيكية التي تسيطر عليها أو الآثار. يمكن استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في كيف تؤثر هشاشة العظام، والعوامل الوراثية و/أو تحميل مختلف الأنظمة العلاجية على الضعف في الموقع تشوندروسيتيس.
Abstract
التوازن غضروف مفصلي يعتمد على بقاء خلايا المقيم (تشوندروسيتيس). لسوء الحظ، يمكن للصدمات الميكانيكية حمل الموت تشوندروسيتي على نطاق واسع، يمكن أن يفضي إلى انهيار لا رجعة فيها المشترك وظهور هشاشة العظام. بالإضافة إلى ذلك، المهم الحفاظ على استمرارية chondrocyte في osteochondral الابتزاز الإجراءات للنتائج الجراحية المثلى. نحن نقدم طريقة لتقييم مدى الضرر/موت الخلايا على السطح المفصلي للمفاصل الزلالي مورين سليمة المكانية بعد تطبيق الأحمال الميكانيكية التي تسيطر عليها أو الآثار. يمكن استخدام هذا الأسلوب في الدراسات المقارنة للتحقيق في آثار أنظمة مختلفة تحميل الميكانيكية، وظروف بيئية مختلفة أو التلاعب الجيني، وكذلك مختلف مراحل انحلال الغضروف على قصيرة أو طويلة الأجل ضعف chondrocytes مفصلي في الموقع. وهدف البروتوكول في المخطوطة لتقييم مدى الضرر/موت الخلايا على السطح المفصلي للمفاصل الزلالي موريني المكانية. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب من الاختبار في غضروف سليمة تماما دون المساس بشروط الحدود الأصلية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح للتصور في الوقت الحقيقي لحيوية الملون chondrocytes مفصلي وتحليل واحد يستند إلى صورة خلية الضرر الناجم عن تطبيق الساكنة التي تسيطر عليها وأثر تحميل أنظمة. تثبت النتائج التي توصلنا إليها الممثل أنه في explants الغضاريف صحية، تعتمد حساسية المكانية مدى إصابة الخلية على كثافة حجم وتأثير الحمل. لدينا طريقة يمكن تكييفها بسهولة للتحقيق في آثار أنظمة مختلفة تحميل الميكانيكية، وظروف بيئية مختلفة أو تلاعب الوراثية المختلفة على ضعف الميكانيكية في الموقع chondrocytes مفصلي.
Introduction
غضروف مفصلي (AC) هو حمل الأنسجة التي تغطي وتحمي العظام في المفاصل الزلالي، توفير سلاسة صياغة مشتركة. التوازن الأنسجة مرهون ببقاء chondrocytes، نوع الخلية الوحيدة المقيمة في التيار المتردد. ومع ذلك، تعرض الغضروف للقوى المتطرفة بسبب الصدمة (مثلاً، شلالات، الإصابات الرياضية أو حادث سيارة) أو بسبب عدم الاستقرار المشترك اللاحق للصدمة يمكن أن يستحث الموت تشوندروسيتي، مما أدى إلى انهيار لا رجعة فيه للمشترك (هشاشة العظام) 1-علاوة على ذلك، في أوستيوتشوندرال تطعيم الإجراءات التي تهدف إلى إصلاح العيوب المحلية في الغضاريف التالفة، الفساد المرتبطة بالإدراج من الصدمات الميكانيكية يقلل من جدوى تشوندروسيتي وله آثار ضارة على نتائج العمليات الجراحية2.
غضروف explant نماذج تستخدم عادة لدراسة قابلية chondrocytes مفصلي لموت الخلايا المستحثة ميكانيكيا. عادة ما تستخدم هذه النماذج explants من الحيوانات الكبيرة لدراسة آثار تحميل الشروط والظروف البيئية والعوامل الأخرى في الخلية الضعف3،4،،من56، 7،،من89،10،11،12،13،،من1415. ومع ذلك، نظراً للحجم الكبير لآلام المفاصل، عموما هذه النماذج تتطلب إزالة المكونات من سطح مفصلي مشتركة سليمة، وبالتالي الإخلال بشروط الحدود الأصلية. وعلاوة على ذلك، أنها تتطلب بشكل عام تطبيق الأحمال الميكانيكية الكبيرة للحث على إصابة الخلية. وبدلاً من ذلك، الغضروف مورين explant النماذج توفر العديد من المزايا على نماذج حيوانية أكبر في دراسة ميكانيكية تعرض في الموقع تشوندروسيتيس. على وجه الخصوص، بسبب أبعادها أصغر، تيسير هذه النماذج اختبار غضروف مفصلي سليمة تماما دون تغيير سلامة الأنسجة الأصلية. وبالإضافة إلى ذلك، يحدث التحميل الغضروف مورين على مناطق الاتصال الصغيرة مثل أن يمكن أن يتسبب chondrocyte الموت/الإصابة مع كميات صغيرة (< 1 N). وأخيراً، جينوم الفأر هو بسهولة التلاعب بها، تمكين اختبار تأثير جينات محددة كيف القابلية في الموقع تشوندروسيتيس للإصابات الميكانيكية.
والهدف العام للطريقة التي أدخلت في هذه المخطوطة كمياً وتصور في الحقيقي مرة-مدى المكانية الموقع في خلية الموت/الإصابة بسبب الأحمال الميكانيكية المطبقة على الماوس سليمة تماما الغضروف في العظام اكسبلانتس في المختبر. يتطلب هذا الأسلوب تشريح دقيق للمفاصل الزلالي الماوس دون المساس بصلاحية تشوندروسيتي، تليها التجارب الميكانيكية لحيوية الملون explants استخدام جهاز شنت مجهر مماثلة إلى منصة اختبار التي قمنا بتطويرها مؤخرا لتحديد الخصائص الميكانيكية الغضروف موريني16. أثناء اختبار الميكانيكية، جزء كبير من سطح مفصلي (سليمة) من عظم تشريح مرئياً على صورة مجهرية صف واحد، مما يتيح التحليل السريع لبقاء الخلية بعد تطبيق حمولة. قد تم إجراء تحليل مماثل لبقاء الخلية السطحية في explants الغضاريف مورين سابقا، ولكن دون التطبيق المتزامن للتحميل17. وتشمل التطبيقات المحتملة لأسلوب لدينا دراسات مقارنة للتحقيق في ضعف chondrocytes مفصلي لمختلف الظروف البيئية والميكانيكية التي تسيطر عليها، وكذلك الفحص من العلاجات التي تهدف إلى الحد من حساسية من تشوندروسيتيس لتحميل الميكانيكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المذكورة أعلاه استخدمت بنجاح لتصور قابلة للحياة وأصيب الميت في الموقع chondrocytes مفصلي من مفاصل الماوس بعد المقررة الأحمال الميكانيكية أو الآثار. على وجه الخصوص، كنا قادرين على تحليل الميكانيكية تعرض chondrocytes داخل غضروف مفصلي سليمة تماما من المفاصل الزلالي المختلفة اثنين: الركب…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر الدكتور ريتشارد وو ولويس دسلجاديلو لاستخدام السخي من مقياس الأس الهيدروجيني وأوسموميتير. بالإضافة إلى ذلك، المؤلف يود أن يشكر لي أندريا للمساهمة في تطوير نظام الاختبار الميكانيكية الأولى. تم تمويل هذه الدراسة من AR069655 P30 المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
Referências
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
