複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング
Summary
ここでは、凍結し、単一脳の処理時間を節約する代わりとして複数の動物から脳組織をセクション プロトコルを提案します。これは免疫組織化学的に染色変動を減少し、時間セクショニングとイメージングを減少します。
Abstract
組織および免疫組織化学は、顕微解剖学を視覚化し、生体組織内の蛋白質を集中解析のルーチンの方法です。他の科学分野の茄多と同様、神経科学、これらのテクニックを使用します。スライド マウント組織または浮遊セクションに対する免疫組織化学を行うことができます。スライド マウントのサンプルを準備して、時間集中的なプロセスです。Megabrain と呼ばれるテクニックの次のプロトコルは、単一の冷凍ブロックに複数の脳を組み合わせることで最大 90 %cryosection とマウントの脳組織へ搬送時間を短縮しました。さらに、この手法は大規模な組織化学的研究でのラウンドを染色の間見られる変動を削減しました。現在のテクニックは、下流の免疫組織化学的解析で齧歯動物の脳組織を使用するために最適化されていますただし、セクショニングを使用する別の科学的なフィールドに適用できます。
Introduction
ここでは、cryosection 複数齧歯動物脳同時に下流の免疫組織化学的手順を開発した Megabrain と呼ばれる手法のプロトコルを提案する.Megabrain は、複数の動物からのティッシュを含んでいる 1 つのスライドの生産が可能です。この手法は、9 の成体ラット半球または 5 の成人における脳からコロナ セクションを同時にカットする最適化されています。したがって、手法は大規模な免疫組織化学的研究や動物の大規模コホートからスライド マウントの脳組織に行う他の分析に最も適切です。
免疫組織化学には理解し、彼らの表情と特定の組織1,2,3の細胞変化を特徴付ける興味の蛋白質に対して指示される抗体の使用が含まれます。免疫組織化学的の使用は神経科学研究では、脳の4の細胞・分子の理解で助ける他の科学分野の間で流行。多くの動物との脳のセクションを含む大規模な研究は、リソースと時間がかかることができます。など、多面的な根拠、Megabrain の開発がある: セクショニング、マウント、およびその結果以下の試薬を使用しながら、組織を染色を過ごした時間を短縮します。さらに、プロセスを合理化し、同じ複数の脳を染色する能力のラウンド バッチ、免疫組織化学3の制限を染色性変動のいくつかを軽減するのに役立ちます。さらに、Megabrain を区分個別冷凍げっ歯類脳を断面に時間節約代替および動物やでも、試験治療グループ間の組織の迅速な比較により顕微鏡検査の技術。
Protocol
Representative Results
Discussion
それは、融解と再組織の凍結を防ぐために、Megabrain とその周辺の温度を常に監視する必要があります、この手順で考慮必要があります。脳のみ削除できます-20 ° C のフリーザーからに 3 回としてたびにそれに触れると暖かい変動温度、組織と、クリオスタットの左を解凍し、refreezes、テクスチャや異常組織の完全性10のようなゼリーを引き起こしています。したがって、す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH ミッション サポート資金は、本稿で報告された研究をサポートしました。著者は、数字で使用されている画像を撮影のダニエル ・ グリフィスを感謝したいです。
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
