Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen
Summary
Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.
Abstract
Histologie en immunohistochemistry zijn routine analysemethoden te visualiseren van microscopische anatomie en lokaliseren van eiwitten in biologische weefsels. In neurowetenschap, evenals een overvloed van andere wetenschappelijke disciplines, worden deze technieken gebruikt. Immunohistochemistry kan worden gedaan op dia gemonteerd weefsel of de zwevende delen. Voorbereiding van monsters dia gemonteerde is een intensief proces van tijd. Het volgende protocol voor een techniek, genaamd de Megabrain, verminderd de tijd genomen om cryosection en mount hersenweefsel door tot 90% door het combineren van meerdere hersenen in een enkele diepgevroren blok. Bovendien, deze techniek verminderd variabiliteit tussen de rondes, in een grote histochemische studie kleuring gezien. De huidige techniek is geoptimaliseerd voor het gebruik van knaagdier hersenweefsel in downstream immunohistochemische analyses; echter kan het worden toegepast op verschillende wetenschappelijke gebieden die gebruikmaken van cryosectioning.
Introduction
Hier presenteren we het protocol voor een nieuwe methode, die wij Megabrain noemen, ontwikkeld om meerdere knaagdier gelijktijdig voor downstream immunohistochemische procedures hersenen cryosection. Een Megabrain zorgt voor de productie van afzonderlijke dia’s met weefsel van meerdere dieren. Deze techniek is geoptimaliseerd voor het knippen van coronale secties uit 9 volwassen ratten hemisferen, of 5 volwassen volledige hersenen, tegelijkertijd. De techniek is daarom meest toepasselijke in grote immunohistochemische studies of andere analyses gedaan op dia gemonteerde hersenweefsel van een grote cohort van dieren.
Immunohistochemistry impliceert het gebruik van specifieke antilichamen gericht tegen proteïnen van belang om te begrijpen en karakteriseren van hun expressie en cellulaire veranderingen in specifieke weefsel1,2,3. Het gebruik van immunohistochemistry heerst in onderzoek neurowetenschap, onder andere wetenschappelijke disciplines, helpend in het cellulaire en moleculaire begrip van de hersenen-4. Grootschalige studies waarbij veel dieren en delen van de hersenen kunnen zowel de resource en de tijd intensief zijn. Als zodanig, is er een veelzijdig grondgedachte achter de ontwikkeling van het Megabrain: om tijd doorgebracht cryosectioning, montage en kleuring van weefsel, tijdens het gebruik bijgevolg minder reagentia. Bovendien is de mogelijkheid om het proces te stroomlijnen en vlek meerdere hersenen in dezelfde ronde draagt bij tot verlichting van enkele van de variabiliteit tussen de partijen, een beperking van immunohistochemistry3kleuring. Daarnaast segmenteren van een Megabrain is een tijdbesparende alternatief voor het segmenteren van individuele bevroren knaagdier hersenen en zorgt voor een snelle vergelijking van weefsel tussen dieren of zelfs behandelgroepen door microscopie technieken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit moet worden beschouwd tijdens deze procedure dat de temperatuur van de Megabrain en de omgeving moet voortdurend worden gecontroleerd om te voorkomen dat ontdooien en weer bevriezen van het weefsel. De hersenen kan alleen worden verwijderd uit de diepvries van-20 ° C tot aan 3 keer als telkens als het wordt aangeraakt en links in de cryostaat, met een warmere wisselende temperatuur, het weefsel ontdooit en refreezes, waardoor een gelei als textuur en abnormale weefsel integriteit10. Daarom is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH missie steunfondsen ondersteund het onderzoek gemeld in dit manuscript. De auteurs bedank Daniel Griffiths voor het nemen van de beelden die worden gebruikt in de cijfers.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
