Samtidige Cryosectioning af flere gnaver hjerner
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at fryse og afsnit hjernevæv fra flere dyr som en tidsbesparende alternativ til forarbejdning enkelt hjerner. Dette reducerer farvning variabilitet under Immunhistokemi og reducerer tid cryosectioning og billedbehandling.
Abstract
Histologi og Immunhistokemi er rutinemæssige analysemetoder til at visualisere mikroskopiske anatomi og lokalisere proteiner inden for biologisk væv. I neurovidenskab, samt et væld af andre videnskabelige felter bruges disse teknikker. Immunhistokemi kan gøres på dias monteret væv eller frit svævende sektioner. Slide monterede prøver er en intensiv proces, tid. Følgende protokol for en teknik, kaldet Megabrain, reduceres den tid at cryosection og mount hjernevæv af op til 90% ved at kombinere flere hjerner i et enkelt frosne blok. Desuden, denne teknik nedsat variabilitet set mellem farvning runder, i en stor histokemiske undersøgelse. Den nuværende teknik er blevet optimeret til at bruge gnaver hjernevæv i downstream immunhistokemiske analyser; Det kan imidlertid anvendes til forskellige videnskabelige områder, der bruger cryosectioning.
Introduction
Vi præsenterer her, protokol for en roman metode, som vi kalder Megabrain, udviklet til at cryosection flere gnaver brains samtidig for downstream immunhistokemiske procedurer. En Megabrain giver mulighed for fremstilling af enkelt dias indeholdende væv fra flere dyr. Denne teknik er blevet optimeret til at skære koronale sektioner fra 9 voksen rotte halvkugler, eller 5 voksne fuld hjerner, samtidigt. Teknikken er derfor mest gældende i store immunhistokemiske undersøgelser eller andre analyser udført på dias-monteret hjernevæv fra en stor kohorte af dyr.
Immunhistokemi indebærer brug af specifikke antistoffer rettet mod proteiner af interesse at forstå og beskrive deres udtryk og cellulære ændringer i bestemte væv1,2,3. Brugen af Immunhistokemi er udbredt i neuroscience research, blandt andre videnskabelige discipliner, medvirken i den cellulære og molekylære forståelse af hjernen4. Storstilede undersøgelser, hvor mange dyr og hjernen sektioner kan være både ressourcen og tiden intensivt. Der er således en mangesidig rationalet bag udviklingen af Megabrain: at reducere tid brugt cryosectioning, montering, og farvning væv, mens derfor bruge mindre reagenser. Desuden mulighed for at strømline processen og plette flere hjerner i samme runde hjælper med at afhjælpe nogle af variabiliteten mellem farvning partier, en begrænsning af Immunhistokemi3. Derudover skæring en Megabrain er en tidsbesparende alternativ til skæring individuelle frosne gnaver hjerner og giver mulighed for hurtig sammenligning af væv mellem dyr eller endda behandlingsgrupper ved mikroskopi-teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det bør overvejes under denne procedure, at temperaturen i Megabrain og dens omgivelser skal overvåges konstant for at undgå optøning og re nedfrysning af væv. Hjernen kan kun fjernes fra-20 ° C fryser op til 3 gange som hver gang det er rørt og venstre i kryostaten, med en varmere svingende temperatur, vævet smelter og frigives, forårsager en gelé som tekstur og unormale væv integritet10. Derfor er det optimale til at skære af Megabrain alle på én gang.
V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH Mission støttemidler støttet forskning rapporteret i dette håndskrift. Forfatterne vil gerne takke Daniel Griffiths for at tage de billeder, der bruges i tallene.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
