ガラス化と地球温暖化の手順中に胚盤胞の行動の客観的評価のための形態のプロトコル
Summary
タイムラプス形態プロトコル previtrification 介入および地球温暖化後の復旧中に再拡張胚盤胞の収縮の強さを次にご紹介します。プロトコルのアプリケーションは体外受精所タイムラプス顕微鏡装備で可能であるし、最適な胚盤胞のガラス化法の開発にお勧めします。
Abstract
この資料では、ガラス化の前後に個々 のフェーズ中に変更する胚盤胞の量の正確な監視のタイムラプス顕微鏡写真に基づいて胚盤胞の形態の非侵襲的方法について説明します。メソッドは、胚盤胞の収縮と再拡張別の前と後のガラス相を観察することによって胚盤胞凍結保護剤の濃度の異なる暴露の最適のタイミングを探しに役立ちます。この方法では、胚盤胞ガラス化プロトコルを最適化できます。この計測法の有用性の良いデモ、ガラス化のための 2 つの異なる胚盤胞準備のプロトコルが比較されます。折りたたみ人工の胞胚腔を使用して 1 つとガラス化する前にこの介入なし。両方、胚盤胞の体積はタイムラプス顕微鏡写真に続いて、写真編集ソフトウェア ツールで測定されました。Previtrification の段階で 20 秒ごとと 5 分後に地球温暖化の期間に、測定されます。時間ユニットごとの胚盤胞の寸法の変更は、線図でグラフィカルに表示されます。そのまま胚盤胞が縮小する最初と、ゆっくりとリフィルを胞胚腔は、液体で満たされた胞胚腔とガラスに入る長い平衡 previtrification 相を示した。人工的に折りたたまれた胚盤胞の全体の平衡の段階によって縮められた段階のままです。ガラス化段階では、それも変更されませんそのボリューム。以来、胚盤胞の形態は、previtrification ステップの間に人工的に折りたたまれた胚盤胞の一定量を示しています、それはこの段階が短いかもしれないようです。記述されていたプロトコル中に、速度とボリュームの変更、一部胞胚腔収縮または合計胚盤胞の数の強度に基づいて凍結保存後胚盤胞の多くの追加比較パラメーターを提供します崩壊し孵化する、または合計胞胚腔の再膨張する時間。
Introduction
プログラムには体外受精 (IVF) 着床前胚の凍結保存は最近ほとんど体外受精研究室でルーチンの練習です。特定の凍結と氷核生成 (シード) が誘導されたとき、-7 ° C までの胚の制御冷却を可能にしたコンピューター制御冷凍庫の導入により、1985 年に臨床的に使用される遅い胚凍結法を始めた、周辺凍害中1。連続冷却による氷の結晶成長、hyperosmolality の残りの液体の部分と、その結果、脱水症状を引き起こしていると胚細胞の収縮。-30 ° C または-80 ° C で、胚は長期保管のため、液体窒素に飛び込んだでしょう。冷却中に胚や卵子で起こっていた凍結プロトコル2を改善する助けバリアフリー cryomicroscopes だけで観察できます。高いボリュームおよびより多くの流体に含まれる胎生期胚盤胞の凍結は、これらの日3の少ない有望な臨床結果を与えた。
画期的な胚盤胞の凍結保存細胞の脱水が高濃度の凍結保護剤4を使用して冷却する前に場所を取ったガラス化法の導入であった。2 栄養外胚葉細胞5間機械開口することによってガラス化する前に胞胚腔から液体の除去が可能します。新鮮な転送後、子宮腔内に胚盤胞の凍結融解の転送は結果にほぼ匹敵するガラス化と温暖化後即時胚盤胞の生存率は 90% と臨床結果次の上この凍結保存法の胚は、まだされていない標準化された6,7。ガラス化プロトコルと (a)、(b) previtrification ステップ数凍結保護剤の濃度 (c) 個々 のステップ、(d) ガラスの前に崩壊か、人工の胞胚腔の利用期間によって異なります (e)。8を砥石で胚がする必要がありますメソッド、(f) 胚盤胞拡張ステージ、および (g) 平衡/ガラス化温度を崩壊します。凍結保護剤は、細胞毒性することができます、ので、定義もこれらのソリューションに胚盤胞の露出時間。ただし、いくつかの凍結保存メディア メーカーは、非常に柔軟なプロトコルを許可します。
科学者の関心は通常注入6,9,10のより良い予測を用いた新しいバイオ マーカーを見つけることを目的に胚盤胞の再拡張能力を勉強に焦点を当てた。ヒト胚盤胞ガラス化胚盤胞のガラス化と温暖化後はどう前に凍結保護剤を追加する別の手順で水分を取り除く、どのようにいつ凍結細胞と胚盤胞が水分補給方法から削除するが、温暖化の後を再展開でなく説明も理解はします。目的のための方法論の開発と異なる凍結保存の手順中に胚盤胞の行動の定量化された監視は、したがって、理論的根拠です。
様々 なメーカーのタイムラプス顕微鏡だは今前の胚盤胞の挙動と後ガラス化フェーズを監視することが可能。追加のコンピューターのツールを含む、によって (形態) のサイズの測定も可能です。減少を測定や、特定の時間で胚のサイズが増加の退避と復元の間に胚の形態制御の評価を客観化することが可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
凍結保存することができます同様の機器と他のメーカーからソフトウェア ツールを使用して実施するも前後の中に胚盤胞の形態制御の観察のためのプロトコル。タイムラプス システム発生学の調整は、胚の開発の継続的な監視を許可します。この作業の目的は、胚盤胞のガラス化と温暖化の後の準備中に胚盤胞の行動の定量化を導入することだった。これは、タイム スケールの形態変化の?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、研究プログラム P3 0327 研究プロジェクト J3-7177-スロベニア語研究財団によって設立されたの一部です。
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Referências
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