Morfometrica protocollo per la valutazione obiettiva dei blastocisti comportamento durante la vetrificazione e passaggi scaldavivande
Summary
Qui presentiamo un protocollo time-lapse morfometrica per seguire l’intensità della contrazione di blastocisti e re-espansione durante gli interventi di previtrification ed il recupero post-riscaldamento. L’applicazione del protocollo è possibile in vitro fertilizzazione laboratori attrezzati con microscopi time-lapse e raccomanda lo sviluppo di un metodo di vitrificazione blastocisti ottimale.
Abstract
Questo articolo viene descritto il metodo non invasivo di blastocisti morfometria basata su Time-lapse microfotografia per il monitoraggio accurato del volume di una blastocisti cambiando durante diverse fasi prima e dopo la vitrificazione. Il metodo può essere utile nella ricerca per la tempistica ottima di esposizione di blastocisti a diverse concentrazioni di crioprotettori osservando restringimento di blastocisti e re-espansione in diversi pre- e post-vetrificazione fasi. Con questa metodologia, il protocollo di vetrificazione di blastocisti può essere ottimizzato. Per una migliore dimostrazione dell’utilità di questo metodo morfometrico, vengono confrontati due protocolli di preparazione diversi blastocisti per la vitrificazione; uno con l’utilizzo di un artificiale Blastocele crollando e uno senza questo intervento prima di vetrificazione. Entrambe le variazioni di volume dei blastocisti sono seguite da Time-lapse microfotografia e misurate dagli strumenti software di fotoritocco. Le misurazioni sono effettuate ogni 20 secondi in fasi di previtrification e ogni 5 minuti nel periodo post-riscaldamento. I cambiamenti delle dimensioni blastocisti per unità di tempo sono presentati graficamente nei diagrammi di linea. I risultati mostrano una fase di previtrification di equilibrazione lungo in cui la blastocisti intatta prima si restringe e poi lentamente ricariche Blastocele, entrando vetrificazione con un Blastocele fluido-riempita. La blastocisti artificialmente compressa rimane nella sua fase rattrappito attraverso la fase di equilibrazione intero. Durante la fase di vetrificazione, anche non cambia il suo volume. Poiché la morfometria di blastocisti Mostra un volume costante delle blastocisti artificialmente crollate durante il passo di previtrification, sembra che questa fase potrebbe essere più breve. Il protocollo descritto fornisce molti parametri aggiuntivi comparativi del comportamento di blastocisti durante e dopo la crioconservazione in base la velocità e l’intensità delle variazioni di volume, il numero di contrazioni Blastocele parziale o totali blastocisti crolla e il tempo di un Blastocele totale re-espansione o il tempo di schiusa.
Introduction
Crioconservazione degli embrioni preimpianto dall’in vitro programma di fertilizzazione (IVF) è al giorno d’oggi una pratica di routine nella maggior parte dei laboratori IVF. L’embrione lento congelamento Metodo cominciò ad essere usato clinicamente nel 1985, con l’introduzione di specifiche crioprotettori e congelatori controllati dal computer, che ha permesso il raffreddamento controllato degli embrioni fino a-7 ° C, quando la nucleazione di ghiaccio (semina) è stata indotta nella circostanti Crioprotettivi medium1. Di raffreddamento continuo, si svilupperebbe i cristalli di ghiaccio, causando l’iperosmolarità della frazione liquida restante e, di conseguenza, la disidratazione e restringimento delle cellule embrionali. A-30 ° C o da-80 ° C, gli embrioni sarebbero immersi nell’azoto liquido per conservarli più a lungo. Quello che stava accadendo con gli embrioni o ovociti durante il raffreddamento potrebbe essere osservato solo da cryomicroscopes appositamente adattato, che ha contribuito a migliorare la crioconservazione protocolli2. Il congelamento di blastocisti, un volume più alto- e più fluido contenuto fase embrionale, ha dato risultati clinici meno promettenti in quei giorni3.
La svolta nella crioconservazione della blastocisti è stata l’introduzione del metodo di vitrificazione, in cui la disidratazione delle cellule ha avvenuto prima di raffreddamento utilizzando alte concentrazioni di crioprotettori4. La rimozione del fluido da Blastocele prima vetrificazione può essere ottenuta anche facendo un’apertura meccanico tra due delle cellule trofoblastiche cellule5. Anche se il tasso di sopravvivenza immediata blastocisti dopo vitrificazione e il riscaldamento è superiore a 90% e il seguente risultato clinico il trasferimento di blastocisti vetrificate/riscaldato nella cavità uterina è quasi paragonabile ai risultati dopo il trasferimento di fresco embrioni, questo metodo di crioconservazione non è stato ancora standardizzato6,7. Protocolli di vitrificazione variano secondo (a) il tipo e la concentrazione di crioprotettori, (b) il numero di passi previtrification, (c) la durata delle singole fasi, (d) l’uso di un Blastocele artificiale compressione prima di vetrificazione o non, (e). crollando metodi, fase (f) l’espansione di blastocisti e (g) la temperatura di equilibrio/vetrificazione in cui gli embrioni dovrebbero essere vetrificato8. Poiché crioprotettori possono essere tossici per le cellule, il tempo di esposizione di blastocisti per queste soluzioni deve essere ben definito. Tuttavia, alcuni produttori di supporti di crioconservazione consentono protocolli molto flessibile.
L’interesse degli scienziati è solitamente concentrata sullo studio la possibilità di re-espansione di blastocisti con lo scopo di trovare nuovi biomarcatori con una migliore previsione di impianto6,9,10. Come blastocisti umane disidratano alle diverse fasi dell’aggiunta di crioprotettori prima vetrificazione e cosa succede con blastocisti dopo vitrificazione e il riscaldamento, quando crioprotettori devono essere rimosso da cellule, e come le blastocisti reidratare e ri-espandere dopo il riscaldamento, è non ben descritto né capito. Lo sviluppo di una metodologia per l’obiettivo e quantificati monitoraggio del comportamento di blastocisti durante le fasi differenti di crioconservazione è, così, razionale.
Con Time-lapse microscopi di diversi produttori, è ora possibile monitorare il comportamento della blastocisti in pre- e post-vetrificazione fasi. Includendo ulteriori computer strumenti, misure delle loro dimensioni (morfometria) anche possono essere eseguite. Per misurare la diminuzione o aumento delle dimensioni dell’embrione in un dato momento, è possibile oggettivare la valutazione della morfodinamica degli embrioni durante la disidratazione e reidratazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo per l’osservazione di blastocisti morfodinamica durante e dopo la crioconservazione può essere effettuata anche utilizzando strumenti simili e strumenti software di altri produttori. Time-lapse sistemi regolati per embriologia permettono il monitoraggio continuo dello sviluppo embrionale. Lo scopo di questo lavoro era di introdurre la quantificazione del comportamento di blastocisti durante la preparazione di blastocisti per la vitrificazione e dopo il loro riscaldamento. Questo è stato fatto la misurazio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è una parte del progetto di ricerca programma P3-0327 e ricerca J3-7177, fondato dalla Fondazione di ricerca sloveno.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Referências
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