Morphométrique protocole pour l’évaluation Objective du comportement de blastocyste pendant la Vitrification et étapes de réchauffement de la planète
Summary
Nous présentons ici un protocole de time-lapse morphométriques pour suivre l’intensité du rétrécissement du blastocyste et re-expansion durant les interventions de previtrification et récupération après réchauffement. L’application du protocole est possible dans les laboratoires in vitro fertilization équipés de microscopes time-lapse et est recommandée dans le développement d’une méthode de vitrification de blastocyste optimale.
Abstract
Cet article décrit la méthode non invasive de blastocyste morphométrie basée sur microphotographie time-lapse pour le contrôle précis du volume du blastocyste changeant au cours des différentes phases avant et après vitrification. La méthode peut être utile dans la recherche pour le moment optimal de l’exposition à différentes concentrations de cryoprotectants blastocyste en observant le rétrécissement du blastocyste et re-expansion dans différentes avant et phases après vitrification. Avec cette méthode, le protocole de vitrification de blastocyste peut être optimisé. Pour une meilleure démonstration de l’utilité de cette méthode morphométrique, comparaison des deux protocoles de préparation de blastocyste différents pour la vitrification ; l’un avec l’aide d’un blastocèle artificiel s’effondrer et l’autre sans cette intervention avant vitrification. Les deux variations de volume des blastocystes sont suivies de microphotographie time-lapse et mesurées par des outils logiciels de retouche photo. Les mesures sont faites toutes les 20 secondes en phases de previtrification et toutes les 5 minutes dans la période post-réchauffement de la planète. Les changements des dimensions blastocyste par unité de temps sont présentées graphiquement dans les schémas de ligne. Les résultats montrent une phase de previtrification long d’équilibration dans lequel le blastocyste intact tout d’abord se rétrécit et puis lentement recharges le blastocèle, entrant dans la vitrification avec un blastocèle remplis de liquide. Le blastocyste artificiellement réduit reste dans sa phase ratatinée par le biais de la phase d’équilibration ensemble. Au cours de la phase de vitrification, elle aussi ne change pas son volume. Puisque la morphométrie du blastocyste montre un volume constant des blastocystes artificiellement s’est effondrés lors de l’étape de previtrification, il semble que cette étape pourrait être plus courte. Le protocole décrit fournit plusieurs paramètres supplémentaires de comparatives du comportement de blastocyste pendant et après cryoconservation sur la base de la vitesse et l’intensité les changements de volume, le nombre de contractions blastocèle partielle ou totale blastocyste s’effondre et le temps d’une dilatation blastocèle total ou le temps jusqu’à l’éclosion.
Introduction
Cryoconservation d’embryons préimplantatoires depuis le programme de fécondation in vitro (FIV) est aujourd’hui une pratique courante dans la plupart des laboratoires de FIV. L’embryon lente méthode de congélation ont commencé à être utilisés cliniquement en 1985, avec l’introduction des cryoprotecteurs spécifiques et congélateurs commandés par ordinateur, permettant le refroidissement contrôlé des embryons jusqu’à-7 ° C, lorsque la nucléation de glace (semis) a été induite chez les entourant le cryoprotecteur moyen1. Par un refroidissement continu, augmenterait les cristaux de glace, provoquant l’hyperosmolalité de la fraction liquide restante et, par conséquent, la déshydratation et le rétrécissement des cellules embryonnaires. À-30 ° C ou à-80 ° C, les embryons seraient plongés dans l’azote liquide pour une conservation plus longue. Ce qui se passait avec les embryons ou les ovocytes au cours du refroidissement pourrait être observé seulement par cryomicroscopes spécialement adaptés, ce qui a contribué à améliorer les protocoles de cryoconservation2. Le gel des blastocystes, un volume plus élevé et le stade embryonnaire plus fluide-contenus, a donné des résultats cliniques moins prometteuses dans ces jours3.
La percée dans la cryoconservation du blastocyste est l’introduction de la méthode de vitrification, où la déshydratation des cellules a eu lieu avant le refroidissement à l’aide de fortes concentrations de cryoprotecteurs4. L’élimination du fluide de la blastocèle avant vitrification est possible aussi en faisant une ouverture mécanique entre deux trophectoderme cellules5. Bien que le taux de survie de blastocyste immédiate après la vitrification et le réchauffement de la planète est supérieure à 90 % et la suite de résultats cliniques le transfert de blastocyste vitrifié/réchauffé dans la cavité utérine est presque comparable aux résultats obtenus après le transfert de produits frais cette méthode de cryoconservation des embryons, n’a pas encore été standardisé6,7. Protocoles de vitrification varient selon le type et la concentration des cryoprotectants, (b) le nombre d’étapes previtrification, (c) la durée des différentes étapes, (d) l’utilisation d’un blastocèle artificiel s’effondrer avant vitrification, ou non, (e). effondrement des méthodes, stade (f) l’expansion de blastocyste et (g) la température de l’équilibration/vitrification à laquelle les embryons devraient être vitrifié8. Comme cryoprotecteurs peuvent être toxiques pour les cellules, le temps d’exposition de blastocyste à ces solutions doit être bien défini. Cependant, certains fabricants de médias de cryoconservation permettent des protocoles très flexibles.
L’intérêt des scientifiques est généralement axé sur l’étude de la capacité de dilatation de blastocyste dans le but de trouver de nouveaux biomarqueurs avec une meilleure prédiction de l’implantation de6,9,10. Comment les blastocystes humains déshydratent à différentes étapes de l’ajout de cryoprotectants avant vitrification et que se passe-t-il avec les blastocystes après vitrification et le réchauffement de la planète, quand cryoprotecteurs doivent être retirés des cellules et comment réhydrater les blastocystes et Développez à nouveau après le réchauffement de la planète, n’est pas bien décrit ni compris. Le développement d’une méthodologie pour l’objectif et le suivi quantifiés du comportement de blastocystes au cours des étapes différentes de cryoconservation sont donc raison d’être.
Avec les microscopes time-lapse de différents fabricants, il est maintenant possible de contrôler le comportement du blastocyste en avant et les phases après vitrification. En incluant les outils informatiques supplémentaires, mesures de leur taille (morphométrie) peuvent également être réalisées. En mesurant la diminution ou augmentation de taille de l’embryon à un moment donné, il est possible d’objectiver l’évaluation de la morphodynamique des embryons au cours de la déshydratation et de réhydratation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole pour l’observation du blastocyste morphodynamique pendant et après que cryoconservation peut également être effectuée en utilisant des instruments similaires et des outils logiciels provenant d’autres fabricants. Time-lapse systèmes ajustés embryologie permettent la surveillance continue du développement embryonnaire. Le but de ce travail a été d’introduire la quantification du comportement de blastocyste lors de la préparation des blastocystes de vitrification et après leur réchauffement d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est une partie du projet P3-0327 et recherche de programme recherche J3-7177, créée par la fondation de recherche slovène.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Referências
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- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
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