Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜
Summary
여기 previtrification 개입 및 후 지구 온난화 복구 동안 blastocyst 수축 하 고 다시 확장의 강도 따라 시간 경과 형태학 프로토콜 선물이. 프로토콜의 응용 프로그램에서 체 외에서 수정 시간 경과 현미경을 장착 가능 하며 최적의 blastocyst vitrification 방법의 개발에 것이 좋습니다.
Abstract
이 문서 blastocyst morphometry blastocyst의 볼륨 vitrification 전후 개별 단계 변경의 정확한 모니터링에 대 한 시간 경과 microphotography에 따라 비 침 투 적인 방법을 설명 합니다. 메서드는 blastocyst 수축 및 다시-확장 다른 사전 및 사후 vitrification 단계를 관찰 하 여 blastocyst cryoprotectants의 다른 농도에 노출의 가장 최적의 타이밍에 대 한 검색에 유용할 수 있습니다. 이 방법론 blastocyst vitrification 프로토콜을 최적화할 수 있습니다. 이 형태학 방법의 유용성의 더 나은 데모, vitrification에 대 한 두 개의 다른 blastocyst 준비 프로토콜 비교; 붕괴 하는 인공 blastocoel를 사용 하 여 하나 고 하나 vitrification 전에이 개입 없이. 두 blastocysts’ 볼륨 변화는 시간 경과 microphotography 뒤 사진 편집 소프트웨어 도구에 의해 측정. Previtrification 단계에서 매 20 초 및 이후 지구 온난화 기간에 5 분 마다 측정 가져옵니다. 시간 단위 당 blastocyst 크기의 변화는 라인 다이어그램에 그래픽으로 표시 됩니다. 결과 있는 그대로 blastocyst 먼저 축소 및 다음 천천히 입력 vitrification 액체가 채워진 blastocoel와 blastocoel은 긴 평형 previtrification 단계 보여. 인위적으로 축소 blastocyst 전체 평형 단계 긴축된 단계에 남아 있습니다. Vitrification 단계 동안, 그것은 또한 변경 되지 않습니다의 볼륨. Blastocyst morphometry previtrification 단계 동안 인위적으로 축소 된 blastocysts의 일정 볼륨을 보여줍니다, 때문에 그것은이 단계 짧은 것 같다. 설명된 프로토콜 중와 속도 볼륨 변경, 부분 blastocoel 수축 또는 총 blastocyst의 수의 강도 기준 cryopreservation 후 blastocyst 행동의 많은 추가 비교 매개 변수를 제공합니다. 붕괴, 그리고 총 blastocoel 다시 확장 하는 시간 또는 부 화 하는 시간.
Introduction
체 외에서 수정 프로그램 (IVF)에서 인간의 preimplantation 배아의 cryopreservation 요즘 대부분 IVF 실험실에서 일상적인 연습 이다. 느린 배아 동결 방법 특정 cryoprotectants 및 얼음 nucleation (시드)에서 유도 되었다 때-7 ° c, 배아의 제어 냉각을 컴퓨터 제어 냉동 고의 도입으로 1985 년에 임상으로 사용 되기 시작 합니다 주변 cryoprotective 매체1. 연속 냉각에 의해 얼음 결정 성장 할 것, 나머지 액체 분수와, 따라서, 탈수의 hyperosmolality를 일으키는 원인이 되 고 배아 세포의 수축 량. -30 ° C 또는-80 ° C, 배아는 저장을 위해 액체 질소에 뛰어들었다 것 이다. 냉각 하는 동안 배아 또는 oocytes 일어나 cryopreservation 프로토콜2를 개선 하는 데 도움이 특별히 적응된 cryomicroscopes에 의해서만 관찰 될 수 있었다. Blastocysts, 높은 볼륨 및 더 액체 포함 된 배아 단계의 그 일3에서 덜 유망한 임상 결과 주었다.
돌파구는 blastocyst의 cryopreservation에 있는 세포의 탈수 일어났다 cryoprotectants4의 높은 농도 사용 하 여 냉각 하기 전에 vitrification 방법의 소개 했다. Vitrification 전에 blastocoel에서 액체의 제거는 또한 두 trophectoderm 셀5사이 기계적인 개방 함으로써 얻을 수 있습니다. Vitrification 온난 후 즉각적인 blastocyst 생존 율은 90%, 그리고 임상 결과 다음 위에 자 궁 캐비티에 vitrified 따뜻하게 blastocyst의 이전은 거의 결과 신선한 전송 후 배아가 cryopreservation 메서드는 아직 표준화 된6,7되지 않았습니다. Vitrification 프로토콜 (a) 종류와 cryoprotectants, (b) previtrification 단계 수의 농도 (c)의 각 단계, (d), vitrification 전에 붕괴 하는 인공 blastocoel의 사용 기간에 따라 다릅니다 (e). 8vitrified 배아 해야하는에서 방법, (f) blastocyst 확장 단계, 및 (g) 평형/vitrification 온도 축소. Cryoprotectants는 셀에 대 한 독성이 있을 수 있습니다, blastocyst 노출 시간이이 솔루션에는 잘 정의 해야 합니다. 그러나, 일부 cryopreservation 미디어 제조 업체는 매우 유연한 프로토콜을 허용합니다.
과학자의 관심 새로운 생체 이식6,,910의 더 나은 예측을 찾을 목적으로 blastocyst 다시 확장 능력을 공부에 일반적으로 집중 된다. 인간 blastocysts cryoprotectants vitrification 고 무슨 blastocysts vitrification 온난 후 발생 하기 전에 추가의 다른 단계에서 탈수, 어떻게 cryoprotectants 있을 때 셀, 그리고 어떻게 된 blastocysts rehydrate에서 제거 하 고 다시 온난 후 확장, 잘 설명도 이해. 목표에 대 한 방법론의 개발 및 다른 cryopreservation 단계 blastocyst 행동의 정량 모니터링은, 따라서, 근거입니다.
다양 한 제조 업체의 시간 경과 현미경, 그건 이제 사전에서 blastocyst의 동작 및 사후 vitrification 단계 모니터링 가능. 추가 컴퓨터 도구를 포함 하 여 그들의 크기 (morphometry)의 측정 또한 수행할 수 있습니다. 으로 감소를 측정 또는 주어진된 시간에 배아 크기에서 증가 디하이드레이션 및 리하이드레이션 동안 배아의 morphodynamics의 평가 객관성을 가능 하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
동안 blastocyst morphodynamics의 전후 cryopreservation 또한 실시 될 수 있습니다 유사한 악기와 다른 제조 업체에서 소프트웨어 도구를 사용 하 여 관찰에 대 한 프로토콜. 발생 학에 대 한 조정 시간 경과 시스템 배아 개발의 지속적인 모니터링을 허용 합니다. 이 작품의 목적은 vitrification를 자신의 온난 후 blastocysts의 준비 동안 blastocyst 동작의 정량화를 소개 했다. 이 변경에는 날짜 표시줄에 형태학의 객?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 연구 프로그램 P3-0327 및 연구 프로젝트 J3-7177, 슬로베니아어 연구 재단에 의해 설립 된의 일부입니다.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Referências
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