Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile
Neste artigo
Resumo
Resumo
Quinase e pyrophosphokinase enzimas transferir o fosfato gama ou a fracção de pirofosfato de beta-gama de precursores de nucleotídeo trifosfato para substratos para criar produtos fosforilados. O uso de γ -32- P rotulado precursores NTP permite a monitorização simultânea de formação de produto e utilização de substrato por radiografia. Cromatografia em camada fina (TLC) em placas de celulose permite a separação rápida e sensível quantificação do substrato e produto. Apresentamos um método para a utilização da cromatografia de camada fina para analisar a atividade de pyrophosphokinase de uma sintetase de ppGpp purificado (p). Este método anteriormente foi usado para caracterizar a atividade de sintetases nucleotídeo e dinucleótido cíclicas e é amplamente apropriado para caracterizar a atividade de uma enzima que hidrolisa um vínculo de trifosfato de nucleotídeos ou transfere um terminal fosfato de um doador de fosfato para outra molécula.
Introdução
Quinase e pyrophosphokinase (ou diphospho-quinase) enzimas transferir fosfatos de precursores de nucleotídeo trifosfato (NTP) para as moléculas do substrato. Os substratos podem incluir outros nucleotídeos, aminoácidos ou proteínas, carboidratos e lipídios1. Análises de Bioinformatic às vezes podem prever de uma enzima cognato substrato ou substratos com base na similaridade de enzimas caracterizadas, mas validação experimental ainda é necessária. Da mesma forma, a afinidade de uma enzima para sua substrate(s) e a taxa na qual ele catalisa a reação de transferência de fósforo e os efeitos de co-fatores, inibidores ou outros efetores da enzima d....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. inducible superexpressão de uma proteína Histidine-tag
- Amplifica o rsh de c. difficile R20291 DNA genômico.
- Use um polymerase de alta-fidelidade e siga as instruções do fabricante.
- Amplificar a c. difficile rsh usando as primeiras demão
rsh_F (GGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG deGGTACCde CA) e
rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), que introduz uma marca de hexahistidine do C-terminal.
Nota: O KpnI e PstI sites nas sequências de cartilha de corte estão em negrito. - Digerir o vetor de pMMBneo e o produto PCR do rsh-his6 com restrição P....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Apresentamos um método para a purificação da afinidade de uma sintetase do ppGpp (p) de Clostridium difficile e a avaliação da sua actividade enzimática. A Figura 1 demonstra a purificação de proteínas, obtida por cromatografia de afinidade de metal. A segunda fração de eluição (E2) desta purificação foi diálise e utilizada para o ensaio de atividade enzimática. A Figura 2 detalha as etapas necessárias para preparar e re.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Aqui nós relatamos a purificação do RSH com sua Tag de c. difficile e apresentar um método para a quantificação de atividade usando cromatografia em camada fina radiolabeled. Este método foi usado anteriormente para avaliar a atividade das enzimas de ciclase diguanylate de c. difficile, bem como sintetase do ppGpp (p), ciclase de nucleotídeos, quinase e enzimas fosfodiesterase de outros organismos11,12 ,13
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIAID 1K22AI118929-01. EBP foi apoiado por uma bolsa de programa verão Research Fellowship do escritório de pesquisa na Universidade de Old Dominion, Norfolk, Virginia, EUA.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| superexpressão induzível de uma proteína marcada com histidina | |||
| Phusion polimerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Kit de extração | Qiagen | 20021 | |
| Enzima de restrição KpnI | NEB | R0142S | |
| Enzima de restrição PstI | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alfa Competente E. coli ( Alta eficiência) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competente E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| Centrífuga JXN-26 com rotor JLA 10.500 | Beckman Coulter Avanti-Microcentrífuga | ||
| com rotor D3024/D3024R | Scilogex-MaxQ | ||
| SHKE6000 Incubadora | Thermo | Scientific-Ultrasonic | |
| processador | Sonics | VC-750 | |
| Purificação de proteínas por cromatografia de afinidade de níquel | |||
| Ni-NTA | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Colunas de gravidade descartáveis, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL de dispositivo de diálise Spectra/ Por float-A-lyzer G2 (MWCO: 20 kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Ensaio de atividade de proteína por cromatografia em camada finaTanque de | |||
| desenvolvimento de cromatógrafo em camada fina (TLC) | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Placas de polietilenonimina (PEI)-celulose (20 cm x 20 cm, 100 μ m de espessura) com suporte de poliéster | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml de chumbo, 100 μ Ci | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosina 5'-trifosfato (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosina-5'-difosfato sal dissódico (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Tela de fósforo de armazenamento | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 imagem fosforosa | GE Healthcare Ciências da Vida | - |
Referências
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6(2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
