En rening och In Vitro aktivitet Assay för en (p) ppGpp kväveoxidsyntas från Clostridium difficile
Summary
Här, beskriver vi en metod för rening av histidin-taggade pyrophosphokinase enzymer och utnyttja tunnskiktskromatografi av radioaktivt märkt substrat och produkter till assay för enzymatisk aktivitet in vitro. Enzym aktivitet analysen är i stort sett tillämpliga till Kinas, nukleotid cyclase eller fosfor-överföring reaktion vars mekanism inkluderar nukleotid trifosfat hydrolys.
Abstract
Kinas och pyrophosphokinase enzymer överför gamma fosfatet eller den beta-gamma pyrofosfat biexponentiellt från nukleotid trifosfat prekursorer till substrat att skapa fosforyleras produkter. Användning av γ –32– P märkt NTP prekursorer tillåter samtidig övervakning av substrat utnyttjande och produkten bildandet av radiografi. Tunnskiktskromatografi (TK) på cellulosa tallrikar tillåter snabb separation och känsliga kvantifiering av substrat och produkt. Vi presenterar en metod för att utnyttja den tunnskiktskromatografi för att assay pyrophosphokinase aktiviteten av en renad ppGpp kväveoxidsyntas (p). Denna metod har tidigare använts för att karakterisera aktiviteten av cykliska nukleotid och dinukleotid synthetases och passar i stort sett kännetecknar aktiviteten hos ett enzym som hydrolyserar en nukleotid trifosfat obligation eller överför en terminal fosfat från en fosfat donator till en annan molekyl.
Introduction
Kinas och pyrophosphokinase (eller uridin-Kinas) enzymer överföra fosfater från nukleotid adenosintrifosfat (NTP) prekursorer till substrat molekyler. Substratesna kan inkludera andra nukleotider, aminosyror eller protein, kolhydrater och lipider1. Bioinformatiska analyser kan ibland förutsäga ett enzym cognate substrat eller substrat baserat på likheten med kännetecknas enzymer, men experimentell validering är fortfarande nödvändig. Likaså frändskapet av ett enzym för dess substrate(s) och den hastighet som det katalyserar phosphor-överföring reaktionen, och effekterna av co-faktorer,-hämmare, eller andra enzym effektorer måste bestämmas experimentellt. För att undvika utarmning av ATP precursoren av andra ATP-krävande enzymer som förekommer i bakteriell cytoplasman, kräver kvantitativa aktivitet analyser renat protein.
Protein rening av metall affinitetskromatografi har täckts noga i litteratur2,3. Histidin tags bestående av sex på varandra följande histidin rester bifogas till N – eller C-terminus av ett rekombinant protein kan snabba rening av metall affinitet kromatografi4,5,6. Dessa sekvenser är små jämfört med de proteiner de ändra och vanligtvis har minimal inverkan på proteinfunktion, även om de ibland kan förändra protein stabilitet eller enzym kinetik7,8. Histidin taggar på N – och C-termini av samma protein kan ha olika effekter, som är svåra att förutsäga utan att känna till strukturen för proteinet som är i fråga. Histidin Taggar ingår vanligtvis under kloning av ett rekombinant protein genom att utforma primers som kodar sex histidin rester, antingen omedelbart 3′ till den ATG start Codonen eller omedelbart 5′ till den stop kodon av ramen öppen läsning. Efter förstärkning, är hexahistidine-innehållande genen sammanskrivna i en vektor under kontroll av en inducerbara arrangören och uttryckt, vanligtvis i ett laboratorium stam av E. coli. Rekombination proteinet kan sedan vara isolerad på en affinitet harts innehållande immobiliserade divalenta katjoner (vanligen nickel eller kobolt)9. Kontaminerande infödda metall-bindande proteiner kan avlägsnas genom titrering med Imidazol, som konkurrenskraftigt förflyttar bundna protein2. Slutligen elueras målproteinet från kolonnen med högre koncentrationer av Imidazol. Det finns flera kommersiella källor för immobiliserade metall ering hartser, och tillverkarna tillhandahåller rekommendationer för buffert villkor och Imidazol koncentrationer. Efter eluering, kan protein vara analyseras av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE), dialyseras eller används omedelbart i funktionella analyser.
Det finns flera metoder för att indirekt övervaka Kinas aktivitet av koppling ATP fosfat bond hydrolys till en andra reaktion som frigör eller retar en fluorophore eller genererar chemiluminescence, men dessa reaktioner har flera rörliga delar och kan vara logistiskt utmanande10. Det enklaste sättet att mäta specifikt phosphor-överföring verksamhet är att direkt övervaka överföring av en radioaktivt märkt fosfatgrupp från ett kommersiellt tillgängliga γ –32-P NTP föregångare till en icke-radioaktivt substrat11 , 12 , 13. blandningar av radiomärkt substrat och produkter kan separeras och kvantifieras genom tunnskiktskromatografi (TK). TLC använder tredjeparts koncentrationsfördelningen i ett givet lösningsmedel differentiell rörlighet genom att låta lösningsmedlet (flytande fas) migrera genom kapillärkraften över en yta (fast fas) som en blandning av koncentrationsfördelningen varit adsorberade14. Koncentrationsfördelningen som är små och/eller saknar gynnsamma interaktioner med den fasta fasen kommer att migrera längre avstånd från sin ursprungliga plats än koncentrationsfördelningen med högre molekylvikt eller stor frändskap för fast. För granskning av fosfor-överföring öka fosfat beståndsdelarna molekylvikten för molekyler de läggs till och Lägg till negativ jonisk laddning neutral eller sura pH11,12,14. Detta minskar deras rörlighet på en grundläggande yta såsom PEI-cellulosa. När utvecklat i sura kalium fosfatbuffert, kan blandningar av mono-, di-, tri-, tetra- och pentaphosphate arter lätt separeras på PEI-cellulosa, möjliggör kvantifiering av varje art (figur 2, figur 3). Sådana analyser kan utföras med cell lysates som innehåller enzymet av intresse, men detta inkluderar potentialen för aktiviteten av andra kinaser, fosfataser och allmänna ATPases att tömma de substrat eller produkt. För en kvantitativ in vitro- bedömning av enzymaktivitet är det nödvändigt att rena enzymet av intresse.
Guanosinmonofosfat tetraphosphate (ppGpp) och guanosinmonofosfat pentaphosphate (pppGpp) är ribonucleotid signaling molekyler som bildas av överföring av en pyrofosfat grupp från en adenosintrifosfat (ATP) föregångare till, respektive en guanosinmonofosfat diphosphate (BNP) eller guanosinmonofosfat tetraphosphate (GTP) substrat15. Dessa enda ribonucleotid signaler, gemensamt benämnda (p) ppGpp, förmedlar ett cell-wide svar på miljömässig stress kallas den stränga svaren i olika bakteriearter15,16. Två bevarade klasser av enzym katalyserar bildandet (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymer är ‘lång’ bifunktionell (p) ppGpp kväveoxidsyntas/Hydrolaser uppkallad efter deras likhet till förbindelser och plats (p) ppGpp metabola enzymer från Escherichia coli som innehåller kväveoxidsyntas, hydrolas och reglerande domäner, medan små alarmone kväveoxidsyntas (SAS) enzymer är kort monofunktionella synthetases hittade exklusivt i Gram positiva bakterier15, 17 , 18. sporbildande grampositiva bakterien Clostridium difficile kodar förmodad RSH och SAS gener19. Här presenterar vi inledande aktivitet-analyser som bekräftar att enzymet C. difficile RSH är en katalytiskt aktiv ppGpp kväveoxidsyntas (p).
Protocol
Representative Results
Discussion
Här rapporterar vi rening av hans-taggade RSH från C. difficile och presenterar en metod för aktivitet kvantifiering med radiomärkt tunnskiktskromatografi. Denna metod har tidigare använts för att bedöma aktivitet diguanylate cyclase enzymer från C. difficile, samt (p) ppGpp kväveoxidsyntas, nukleotid cyclase, Kinas och fosfodiesteras enzymer från andra organismer11,12 ,13,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av NIAID 1K22AI118929-01. EBP stöddes av en sommar Fellowship Program forskningsanslag från Office av forskningen vid Old Dominion University, Norfolk, Virginia, USA.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
