Hier beschrijven we een methode om te zuiveren intact chloroplasten van Arabidopsis bladeren en hun drie belangrijkste sub compartimenten (envelop, stroma en thylakoiden), met behulp van een combinatie van differentiële centrifugations, continue Percoll verlopen, en discontinue sacharose verlopen. De methode is waardevol voor subplastidial en subcellular localisatie van eiwitten door immunoblotting en proteomics.
Chloroplasten zijn belangrijke componenten van plantaardige cellen. Dergelijke plastiden vervullen vele cruciale functies, zoals de assimilatie van koolstof, zwavel en stikstof, evenals de synthese van essentiële metabolieten. Deze organellen bestaan uit de volgende drie belangrijke sub compartimenten. De envelop, gekenmerkt door twee membranen, omringt het organel en de mededeling van de Plastide met andere compartimenten van de cel regelt. Het stroma is de oplosbare fase van de chloroplast en de belangrijkste site waar kooldioxide wordt omgezet in koolhydraten. Het membraan thylakoïde is het interne membraan netwerk bestaande uit grana (platte gecomprimeerde zakjes) en lamellen (minder dichte structuren), plaats waar oxygene fotosynthese plaatsvindt. Dit protocol beschrijft stap voor stap-procedures die nodig zijn voor de zuivering, met behulp van differentiële centrifugations en Percoll verlopen, van intact chloroplasten van Arabidopsisen hun fractionering, met behulp van sacharose verlopen, in drie sub compartimenten (dat wil zeggen, envelop, stroma en thylakoiden). Dit protocol biedt ook instructies over hoe om te beoordelen van de zuiverheid van deze fracties met behulp van markeringen gekoppeld aan de verschillende chloroplast sub compartimenten. De hier beschreven methode is waardevol voor de lokalisatie van de subplastidial van eiwitten met behulp van immunoblotting, maar ook voor subcellular subplastidial proteomics en andere studies.
Chloroplasten zijn belangrijke componenten van plantaardige cellen. Zij afkomstig zijn van een cyanobacteriën voorouder dat heeft ondergaan een Protista en uiteindelijk geëvolueerd als een organel tijdens evolutie1,2. Deze organellen bevatten drie belangrijkste compartimenten (Figuur 1). De envelop systeem bestaat uit een binnenste en een buitenste membranen rondom het organel. Dit systeem van de dubbele membraan bevat verschillende enzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van lipiden en pigmenten en is vooral gewijd aan de controle van de communicatie tussen plastiden en het cytosol. Het bevat verschillende vervoerssystemen waarmee de import van nucleaire-gecodeerd eiwitten, en de uitwisseling van ionen en metabolieten tussen het cytosol en de chloroplast dus reguleren van essentiële metabole functies van de plant cel3,4 . De stroma, de oplosbare fase van de chloroplast, bevat enzymen van de cyclus van Calvin (CO2 assimilatie), de synthese van verschillende metabolieten met inbegrip van de machines van de transcriptie en vertaling van de Plastide, aminozuren en vitaminen. Het membraan thylakoïde is een grote schaal georganiseerde interne membraan-netwerk waar de lichte fase van fotosynthese plaatsvindt. Chloroplasten zijn daarmee de plaats waar de essentiële stofwisselingsroutes5voorkomen.
Om te ontcijferen nieuwe regulerende mechanismen waarmee de dynamiek van chloroplast en fysiologie, is definiëren de sub-plastidial lokalisatie van chloroplast eiwitten dus kritisch ter ondersteuning van gerichte studies gericht op eiwitten functies beter te begrijpen in model organismen6. Om toegang te krijgen tot de lokalisatie van de echte subplastidial van deze proteïnen, is het dus essentieel om te beginnen uit zeer zuivere subplastidial breuken (envelop membranen, stroma en thylakoiden). In deze context is het doel van het huidige protocol te zuiveren intact chloroplasten van Arabidopsis bladeren met behulp van differentiële centrifugations en continu Percoll verlopen en fractionate hen met behulp van discontinue sacharose verlopen, in drie sub compartimenten (dat wil zeggen, envelop, stroma en thylakoiden). De hier beschreven methode bevat ook instructies voor het beoordelen van de zuiverheid van gezuiverde sub-organellar fracties met behulp van markeringen gekoppeld aan de verschillende chloroplast sub compartimenten. Dit protocol is waardevol voor subplastidial lokalisatie van eiwitten met behulp van immunoblotting en voor verdere analyse van gezuiverde fracties met behulp van spectrometrie van de massa (MS)-op basis van proteomic studies.
Dit artikel is bedoeld voor detail van het stap voor stap-protocol gebruikt voor het zuiveren van chloroplasten (en hun sub compartimenten) van Arabidopsis thaliana. Sinds de beschikbaarheid van het volledige genoom bijna twee decennia geleden, met grote collecties van insertiemutanten ter beschikking gesteld van de Gemeenschap, Arabidopsis nu algemeen aanvaard wordt als een model plant. Echter terwijl deze plant perfect voor genetische benaderingen aangepast was, plantaardige wetenschappers nodig aan te passen van biochemische en fysiologische tools om dit nieuwe model. Protocollen toestaan om te zuiveren van fotosynthetische actieve chloroplasten uit bladeren van gevestigde biochemische modellen zoals spinazie12 of pea13 dus moest worden aangepast. De eerste methode beschrijven van zuivering van Arabidopsis chloroplasten werd gepubliceerd in 199814, net voor de release van het Arabidopsis genoom. Enkele jaren later, eenvoudige methoden voor het isoleren van Arabidopsis chloroplasten compatibel met studies gericht op het analyseren van in vitro invoer van proteïnen in gezuiverde organellen aangebracht beschikbaar15,16. Echter, deze methoden niet in staat om het combineren van de hoge mate van zuiverheid en behoud van fotosynthetische activiteit van de gezuiverde chloroplasten. Meer recentelijk werd17, een snelle methode opgericht, die is gebaseerd op het gebruik van Percoll verlopen en maakt het mogelijk om bijna 90% van het gemeten in de startende bladeren van Arabidopsis fotosynthese te behouden.
Het protocol hier beschreven staat voor het zuiveren van Arabidopsis chloroplasten op een uitstekend niveau van zuiverheid. Inderdaad, immunologische opsporing van contaminanten in andere cel compartimenten aangetoond dat de gezuiverde organellen verstoken van mitochondriale zijn en plasmamembraan markeringen9,10. Dit protocol was ook efficiënt te zuiveren chloroplasten van verschillende Arabidopsis geneeskrachtig18, zoals Columbia (Col) of Wassilewskija (WS), dat wil zeggen, de geneeskrachtig die werden gebruikt voor genoom of uitgedrukt tags (ESTs) volgorde rangschikken projecten maar ook aan T-DNA insertiemutanten Arabidopsiste genereren. Met andere woorden, als proteomics studies worden uitgevoerd moeten, is het huidige protocol compatibel met deze twee referentie geneeskrachtig van Arabidopsis. Tot slot, de opbrengst van chloroplasten met behulp van dit protocol is vergelijkbaar met degene die zijn verkregen bij het starten van spinazie of pea bladeren (dat wil zeggen, 3%, gemeten vanaf het gehalte aan chlorofyl in de Percoll-gezuiverd chloroplast in vergelijking met de totale chlorofyl bedrag aanwezig bij het starten van bladeren). In termen van eiwitten is de opbrengst dicht bij 50 mg chloroplast eiwitten, wanneer organellen zijn gezuiverd van 500 g van 5-week-oude Arabidopsis bladeren.
Tot zo’n goede opbrengst (en chloroplast integriteit), een moet echter bijzondere aandacht besteden aan verschillende stappen bij het gebruik van dit protocol. De chloroplast Arabidopsis is een uiterst kwetsbare structuur (dit is niet het geval voor pea chloroplasten, bijvoorbeeld). Bijzondere aandacht is dus nodig om te voorkomen dat grootschalige breuk van de organellen tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. Het aantal en de grootte van zetmeel korrels aanwezig is in chloroplasten zijn kritisch voor de bereiding van intact chloroplasten. Inderdaad, chloroplasten met grote zetmeel graan zal over het algemeen worden verbroken tijdens eerste differentiële centrifugations stappen willen concentreren van de ruwe chloroplast breuken12. Daarom moeten de planten ‘s nachts worden bewaard in een donkere en koude kamer (4 ° C) voordat het experiment, de hoeveelheid zetmeel te beperken.
Nieuwe gebruikers van het huidige protocol zou geneigd zijn te starten vanaf grotere hoeveelheden materiaal van het blad (grote rozetten van oude Arabidopsis planten met grotere bladeren) proberen te verbeteren van het herstel van gezuiverde chloroplasten. Echter, in onze handen, vanaf jonge bladeren (5-week-oude) is het beste compromis opbrengst, zuiverheid, en integriteit van de gezuiverde organellen te combineren. Inderdaad, ook oude bladeren zijn hoogverrijkt in fenolische verbindingen die een negatieve impact hebben op chloroplast integriteit19te zien waren.
Ten slotte, de stap van de eerste extractie (het fijnstampen van het weefsel) is een andere belangrijke stap. De overvloeimodus proces moet beperkt blijven tot enkele seconden. Zoals hierboven vermeld, zou nieuwe gebruikers geneigd zijn te gebruiken met langere mengen, dus verwacht te sterk verbeteren van het rendement van gezuiverde organellen. Als langere mengen effectief releases meer materiaal van bladeren, lijkt echter dat het aandeel van gebroken chloroplasten snel in het ruwe cel extract verhoogt. Verdere zuivering stappen (scheiding op Percoll hellingen) zijn sterk beïnvloed als gevolg van deze hoge verhouding van gebroken aan intact chloroplasten in het medium, en de opbrengst van de zuivering is onverwacht lager.
Beschikbaarheid van specifieke protocollen voor het zuiveren van organellen hebben een aantal hoge-doorvoer proteomics gebaseerde experimenten te worden uitgevoerd op monsters die zijn chloroplast toegestaan. Deze gegevens werden gemaakt beschikbaar in verschillende openbare databanken6, waardoor aan biologen op het gebied van een nauwkeurige subcellular (en subplastidial) lokalisatie voor vele chloroplast eiwitten. Dit was vooral het geval voor de envelop eiwitten wiens identiteit en locatie bleef grotendeels onbekend voordat deze analyses, omdat envelop membranen een kleine chloroplast component (1-2% van de eiwitten chloroplast vertegenwoordigen) tijdens het spelen een sleutelrol in de chloroplast metabolisme en biogenese5,20. Met het protocol beschreven hier, wij onlangs geanalyseerd de samenstelling van de drie belangrijkste chloroplast compartimenten van Arabidopsis (dat wil zeggen, de stroma, de thylakoiden en de envelop membraan systeem)9. Gebaseerd op een benadering van de semi-kwantitatieve proteomics (spectrale tellen), konden we beoordelen de partitionering van honderden eiwitten in deze drie chloroplast compartimenten.
Terwijl het huidige protocol mogelijk maakt om te zuiveren van de drie belangrijkste compartimenten van de chloroplast van Arabidopsis, is het ook mogelijk om te onderscheiden van extra sub compartimenten in de chloroplast. Inderdaad, de envelop membraan systeem is gemaakt van de binnenste en de buitenste omslag membranen (Figuur 1). Tot de beste van onze kennis, een methode voor het zuiveren van de envelop van de binnenste en buitenste membranen van Arabidopsis chloroplasten echter tot stand worden gebracht. Envelop van de binnenste en buitenste membranen kunnen van spinazie21 of pea22 chloroplasten gezuiverd worden. De belangrijkste beperking van Arabidopsis komt meestal voort uit de beperkende hoeveelheid grondstof. Vanaf 500 g van Arabidopsis bladeren (waarvoor reeds 1 m2 oppervlakte in een groei-kamer) kunt slechts 100 µg envelop eiwitten te zuiveren. Aan de andere kant, is het gemakkelijk om te beginnen met 5-10 kg mag bestaan uit spinazie vertrekt vanuit de markt, voor het zuiveren van de grote hoeveelheid chloroplasten8 en te eindigen met een rendement van 3 tot en met 10 mg envelop eiwitten uit dit materiaal.
Hetzelfde geldt voor thylakoïde sub compartimenten. Inderdaad, ze zijn gemaakt van licht membraan blaasjes (lamellen) en dichte structuren (grana) (Figuur 1). Specifieke protocollen zijn beschikbaar voor het onderscheiden van deze twee compartimenten in Arabidopsis23,24. Nogmaals, op basis van een analyse van de kwantitatieve proteomics, wij onlangs de eiwitten aanwezig in deze twee sub compartimenten24geïnventariseerd. Deze benaderingen, samen met een diepgaand onderzoek van de literatuur, toegestaan valideren, of hypothesen stelt voor, de locatie van de subplastidial van honderden thylakoïde eiwitten. Het is echter belangrijk op te merken dat de extra membraan microdomains aanwezig op de gebogen rand van ze zijn. Deze lipoproteïne sub compartimenten, of plastoglobules, zijn permanent gekoppeld aan thylakoïde membranen en bevatten een specifieke set van eiwitten25. Met behulp van dit protocol, is het dus niet mogelijk om te onderscheiden van deze specifieke proteïnen van andere thylakoïde componenten.
Sommige echte (bekende) envelop, stroma of thylakoïde onderdelen zijn nog steeds ontbreekt in de lijsten van gedetecteerde eiwitten. Samen met gerichte biochemische en immunologische analyses, zal de voortdurende verbetering van MS gevoeligheid zitten van tof steun om opnieuw de chloroplast inhoud naar een volledige repertoire van de samenstelling van de verschillende sub compartimenten.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door een gezamenlijke PhD fellowship aan IB van het INRA plantenbiologie en fokken divisie en van de Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Wij willen ook te erkennen van de ANR project ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Parijs) op antilichamen tegen LHCP en Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) op antilichamen tegen KARI.
Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
Tricine | Roth | 6977.2 | |
Sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | H5032 | |
NaHCO3 | Roth | 8551.1 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.5 | |
MgCl2 | Roth | 2189.1 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Benzamidine | Sigma | B6506 | |
ε-amino caproic acid | Fluka | 21530 | |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Roth | 6979.3 | |
Sucrose | Roth | 9286.2 | |
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide | Roth | 3029.1 | |
Tris | Fisher | BP152-5 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Roth | 1057.1 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T-8133 | |
Ammonium persulfate (APS) | Roth | 9592.1 | |
Glycerol | Roth | 3783.1 | |
Bromophenol blue | USB | US12370 | |
Glycin | Roth | 3908.3 | |
Gel staining medium | Clini-sciences | GEN-QC-STAIN | |
Ethanol | CARLO ERBA | 528151 | |
NaCl | Euromedex | 1112-A | |
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
Fat-free milk powder | Régilait | ||
HCl | Fisher | H/1150/PB15 | |
KOH pellets | Sigma | 1.05012 | |
NaOH pellets | CARLO ERBA | 480507 | |
Anti-HMA1 antibody | Seigneurin-Berny et al, 2006 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-KARI antibody | Ferro et al, 2010 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-LHCP antibody | Vallon et al, 1991 | Used at a 1:25,000 dilution | |
P-coumaric acid | Sigma | C-9008 | |
Luminol (3-aminophalhydrazin) | Fluka | 9253 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO). | Sigma | D5879 | |
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases | Puteaux | 162135 | |
A. thaliana seeds | Around 30 mg of seeds for a whole case | ||
Compost "Floragard" | Puteaux | 16311770 | |
Growth rooms | 12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s. | ||
Muslin or cheesecloth | Raffin | 70116 | 80-cm-large |
Nylon blutex 50 μm aperture | Tripette et Renaud, Sailly Saillisel | 50 μm aperture | |
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity | Waring Blender | ||
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles) | Beckman Coulter | ||
Beckman JA-20 rotor | Beckman Coulter | ||
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes) | Sorvall instruments | ||
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
Ultracentrifuge (Beckman L7) | Beckman Coulter | ||
Centrifuge (Beckman JSE-06D18) | Beckman Coulter | ||
Microcentrifuge | Eppendorf 5415D or equivalent | ||
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube. | |||
Nitrocellulose membranes | BA85, Schleicher and Schuell | ||
Filter paper | 3MM, Whatman, Maidstone | ||
Liquid nitrogen | |||
Peristaltic pump | Gilson | ||
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus). | Bio-Rad Protean 3 or equivalent | ||
System for protein transfer to nitrocellulose membranes | Bio-Rad Protean 3 or equivalent |