Alterazioni nei tassi metabolici di misurazione è fondamentale per comprendere la progressione di varie malattie e invecchiamento. Qui, presentiamo una nuova tecnica per misurare il consumo di ossigeno tutta la testa che maggiormente assomiglia lo stato fisiologico e può essere di aiuto nel rivelare nuovi farmaci che modificano l’attività mitocondriale.
Regolamentata l’attività metabolica è essenziale per il normale funzionamento delle cellule viventi. Infatti, attività metabolica alterata causale è collegato con la progressione del cancro, il diabete, neurodegenerazione e invecchiamento per citarne alcuni. Per esempio, cambiamenti nell’attività mitocondriale, powerhouse metabolica delle cellule, sono stati caratterizzati in molti tali malattie. Generalmente, i tassi di consumo di ossigeno dei mitocondri sono stati considerati una lettura affidabile di attività mitocondriale e misure in alcuni di questi studi si basavano su mitocondri isolati o cellule. Tuttavia, tali condizioni non possono rappresentare la complessità di un intero tessuto. Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo metodo che consente la misurazione dinamica dei tassi di consumo di ossigeno da teste volare intero isolate. Utilizzando questo metodo, abbiamo registrato più bassi tassi di consumo di ossigeno del segmento tutta la testa nella giovane contro invecchiato mosche. In secondo luogo, abbiamo scoperto che gli inibitori di deacetylase lisina alterano rapidamente il consumo di ossigeno in tutta la testa. La nostra tecnica novella pertanto può aiutare nella scoprendo nuove proprietà di varie droghe, che possono incidere tassi metabolici. Inoltre, il nostro metodo può dare una migliore comprensione del comportamento metabolico in un’installazione sperimentale che più assomiglia stati fisiologici.
Regolamentata l’attività metabolica è essenziale per la sopravvivenza delle cellule e la funzione sana di un tessuto. Attività metabolica deregolamentato ha dimostrato ampiamente di essere collegato all’inizio e la progressione di varie malattie1. Ad esempio, minore attività metabolica è stata precedentemente descritta nelle malattie neurodegenerative come l’Alzheimer e danno età-collegato di memoria2,3. Inoltre, la disfunzione mitocondriale è creduta per essere causalmente coinvolti in invecchiamento processo4,5. D’altra parte, più alti tassi metabolici e mitocondriali sono stati descritti in cancro cellule6, dove l’uso di inibitori mitocondriali ridotta tumorigenesi7.
Una lettura di attività metabolica è il tasso di consumo di ossigeno (OCR) dei mitocondri. Interessante, questo tipo di lettura è ottenuto principalmente da mitocondri isolati o cellule, così la maggior parte di ciò che è descritto nella letteratura si basa principalmente su una lettura che non assomiglia a stati fisiologici. Tuttavia, ci sono diversi inconvenienti a questa tecnica. In primo luogo, il protocollo di isolamento mitocondriale possa potenzialmente danneggiare la sua integrità8, che potrebbe essere un manufatto pertinente quando si confrontano i mitocondri isolati dai giovani contro vecchi tessuti9. Inoltre, il processo di isolamento è lungo e potrebbe causare perdita di modifiche di posttranslational rilevanti proteine che regolano la funzione mitocondriale9,10,11. Inoltre, è stato dimostrato che i mitocondri isolati non rappresentano costantemente intero tessuto tassi metabolici12,13. Tale complessità biologica cellulare potrebbe essere visto come, ‘il tutto è maggiore della somma delle sue parti’, cioè, i mitocondri possono visualizzare diversi tassi metabolici all’interno di un complesso cellulare rispetto al loro tasso metabolico quando isolato.
Mentre le cellule possono offrire una migliore lettura OCR di mitocondri isolati, la comunicazione tra cellule nel contesto di un intero tessuto potrebbe perdersi. Ad esempio, nel cervello, l’attività metabolica dei neuroni dipende fortemente l’attività metabolica delle vicine cellule gliali14. Come tale, che istituisce nuove tecniche per studiare OCR nell’intero tessuto o interi organismi può rivelarsi più penetranti per l’insorgenza e la progressione di vari disturbi.
Recentemente, sono emerse nuove tecniche per affrontare questi problemi e consentire la misura di OCR dall’intero tessuto, segmento o gli organismi viventi. Ad esempio, un recente lavoro ha riferito la misurazione di ossigeno da un muscolo di volo beetle utilizzando un approccio di permeabilized fibra con un respirometro15. Nuove macchine per micro-respirometry consentono la misura di OCR di isolotti pancreatici16,17. Di conseguenza, è stato segnalato che questa tecnologia consente la misurazione di OCR da intero vermi18 e pesce Zebra19. Tuttavia, la presenza della barriera digestiva può proporre una sfida per testare i vari farmaci nel contesto delle alterazioni di OCR. Interessante, i rapporti recenti di Neville e colleghi hanno indicato una nuova tecnica per la misurazione del cervello della larva della drosofila singolo con la piastra ben20,21.
In questo studio, abbiamo utilizzato una configurazione simile per consentire la misurazione della intera OCR da vivente complesso e non mobile Drosophila22. Questa tecnica offre anche un vantaggio secondario a misurare l’impatto di varie droghe su attività metabolica in un intero segmento, senza dover passare attraverso il sistema digestivo barriera13,22. Ad esempio, è stato precedentemente dimostrato che iniezione diretta dell’inibitore delle deacetilasi di lisina (KDACi), un farmaco creduto di alterare il meccanismo epigenetico nel cervello, ha provocato un miglioramento ricordi formazione23. Tuttavia, utilizzando la nostra tecnica innovativa, abbiamo scoperto che l’inibizione di KDAC ha provocato un rapido aumento di OCR, che può essere un fattore che contribuisce di per sé nell’attività neuronale. Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice e romanzo per valutare l’impatto di vari farmaci, manipolazioni genetiche o stati fisiologici (malattia, invecchiamento) su OCR nel contesto di tutta la testa.
La nostra nuova tecnica offre un nuovo approccio per studiare i cambiamenti metabolici nell’invecchiamento e malattia nel contesto dell’intero tragitti testa22. Il metodo può essere adatto anche per studiare l’impatto del butirrato del sodio KDAC sul consumo di ossigeno. Come abbiamo dimostrato, inibitori di deacetlyase di lisina (HDACs/KDACs) provocare i cambiamenti di OCR. Essenzialmente, come gli obiettivi di tali inibitori sono normalmente non localizzati nei mitocondri (questi inibitori non impatto la deacetilasi di classe III, le sirtuine)24, tali farmaci potrebbero essere testati solo su un minimo livello del tessuto. Infatti, vari farmaci sono iniettati direttamente al cervello, aggirando così possibile elaborazione/modifica/inattivazione dal sistema digestivo. Come tale, la nostra tecnica offre romanzo spaccato di come tali droghe direttamente impatto il segmento di testa.
Ci sono diversi passaggi critici. In primo luogo, come indicato nel protocollo, si consiglia di preparare un piatto meno di un’ora, con due paia di mani preparando la piastra. Dalla nostra esperienza, la qualità e la stabilità delle misurazioni OCR sono migliori se preparati in modo tempestivo. Quando tenuto troppo a lungo, l’avvenimento basso pozzi che richiede OCR sta aumentando, come pure di durata più breve di OCR stabile. In secondo luogo, è importante effettuare un controllo di qualità e garantire che le condizioni sperimentali tra vari campioni sono simili (pH, livelli di ossigeno). Infine, un passo fondamentale è scelta dell’algoritmo corretto per analizzare i campioni. Come abbiamo dimostrato, l’algoritmo AKOS predefinito ha reso un calcolo fuorviante e a volte opposto in campioni che consuma ossigeno alle tariffe alta13. Pertanto, sottolineiamo l’importanza di verificare i dati grezzi per i livelli di ossigeno e confrontando l’OCR risultante.
Attualmente, ci sono diverse limitazioni con questa tecnica. A temperatura ambiente, la macchina si riscalda fino a 31 ° C (questa è la temperatura di misurazione minima mentre la macchina è a temperatura ambiente), che può rappresentare uno stato di stress per le teste volare25. Questo, tuttavia, può essere superato mettendo la macchina in una stanza fredda, che permetterà misurazioni a 25 ° C e quindi senza uno stress termico le testine di volare. Recente rapporto ha dimostrato ponendo la macchina a 11 ° C, consentendo in tal modo la registrazione di OCR di mosche a 25 ° C21. Tuttavia, la separazione di testa Vola dovrebbe essere eseguita a temperatura ambiente. Inoltre, le fluttuazioni di temperatura lo rendono difficile da cambiamenti di pH di controllo e pertanto si consiglia vivamente di testare l’impatto di condizioni fisiologiche/droghe su OCR utilizzando configurazioni sperimentali simili. Inoltre, il contributo del consumo di ossigeno da meccanismi non-mitocondriale-indipendente non è ancora stato stabilito26. Utilizzando vari inibitori respiratori che sono efficienti nel volare teste, sarebbe possibile stabilire tali tassi di consumo di ossigeno non mitocondriale.
È interessante nota che varie malattie nei mammiferi sono caratterizzati da alterazioni nel metabolismo energetico. Fra loro sono malattie che sono caratterizzate da una riduzione metabolica come il morbo di Alzheimer o metabolici ricablaggio come il cancro. È interessante notare che, KDAC inibitori sono usati per il trattamento del morbo di Alzheimer ed il cancro27. Mentre i meccanismi precisi di cui KDAC inibitori stanno raggiungendo l’aspetto terapeutico rimangono poco chiari, i dati dalla nostra tecnica supportano la nozione di romanzo che tali inibitori possono modulare il metabolismo.
In sintesi, questo metodo è utile per misurare il consumo di ossigeno nel complesso i tassi in vivo e visualizza più accuratamente gli effetti della droga sul metabolismo generale, che può essere trascurata nei mitocondri isolati protocolli12. Ad esempio, risultati ottenuti da questo metodo, piuttosto che tecniche precedenti, sono implicati comprensioni novelle per età-collegata di inflessibilità metabolica previo trattamento di KDAC. Mentre il lavoro supplementare è necessario per ottimizzare le condizioni sperimentali per volano teste, la combinazione della nostra tecnica e analisi adeguati può portare a ulteriore delucidazione dell’attività mitocondriale nel contesto di tessuti viventi intero.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Andreas Ladurner, Carla Margulis e le loro squadre per ampio supporto sperimentale. Ringraziamo Caitlin Ondracek per i suoi commenti sul manoscritto. Vorremmo ringraziare Sofia Vikstrom per ci ha aiutato a stabilire le prime fasi di questa tecnica. Ringraziamo anche può Sanderhoff per il suo aiuto tecnico. LB è finanziato dal Ministero federale tedesco dell’istruzione e della ricerca (Infrafrontier grant 01KX1012). SP è stato finanziato da una borsa di studio post-dottorato di AXA Research Fund e NSFC (concessione numero 81870900). AVV è finanziato dal QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |