Mäta förändringar i metabola priser är centrala för förståelsen av progressionen av olika sjukdomar och åldrande. Här presenterar vi en ny teknik för att mäta hela huvudet syreförbrukning som närmare liknar det fysiologiska tillståndet och får stöd i avslöjar nya läkemedel som ändrar mitokondriell aktivitet.
Reglerade metabolisk aktivitet är viktigt för normal funktion av levande celler. Faktiskt är förändrade metaboliska aktiviteten causally knutet till utvecklingen av cancer, diabetes, neurodegeneration och åldrande för att nämna några. Till exempel har förändringar i mitokondriell aktivitet, cellens metaboliska kraftpaket, präglats i många sådana sjukdomar. Generellt de syre förbrukning av mitokondrier ansågs en tillförlitlig avläsning av mitokondriell aktivitet och mätningar i några av dessa studier baserades på isolerade mitokondrier eller celler. Sådana villkor får dock inte representera komplexiteten i en hela vävnad. Nyligen, har vi utvecklat en ny metod som möjliggör dynamisk mätning av syre förbrukning från hela isolerade flyga huvuden. Genom att använda denna metod, har vi spelat in lägre syre förbrukning för segmentet hela huvudet i unga kontra åldern flugor. För det andra har vi upptäckt att lysin histondeacetylas hämmare snabbt ändra syreförbrukningen i hela huvudet. Vår ny teknik kan därför hjälpa avslöja nya egenskaper hos olika läkemedel, som kan påverka ämnesomsättning priser. Vår metod kan dessutom ge en bättre förståelse av metabola beteende i ett experiment som mer liknar fysiologiska stater.
Reglerade metabolisk aktivitet är viktigt för överlevnaden av celler och friska funktion av en vävnad. Avreglerad metabolisk aktivitet har visats i stor utsträckning kopplas till uppkomsten och utvecklingen av olika maladies1. Lägre metabolisk aktivitet beskrevs exempelvis tidigare neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och ålder-associerade minne nedskrivningar2,3. Mitokondriell dysfunktion är dessutom tros vara kausalt inblandade i åldrande processen4,5. Däremot, var högre mitokondrie och metabola priser beskrivs i cancer celler6, där användningen av mitokondriell hämmare reduceras tumourigenesis7.
En avläsning av metabolisk aktivitet är syre materialåtgången (OCR) av mitokondrier. Intressant, denna typ av avläsning erhålls huvudsakligen från isolerade mitokondrier eller celler, alltså majoriteten av vad som beskrivs i litteraturen baseras huvudsakligen på en avläsning som inte liknar det fysiologiska tillståndet. Dock finns det flera nackdelar med denna teknik. Det första kan protokollet av den mitokondriella isolering potentiellt skada dess integritet8, vilket kan vara en artefakt som är relevanta när man jämför mitokondrier isolerade från unga jämfört med äldre vävnader9. Dessutom isolering processen är lång och kan resultera i förlust av relevanta protein posttranslationell ändringar som reglerar mitokondriefunktion9,10,11. Det har dessutom visat att isolerade mitokondrierna inte konsekvent företräder hela vävnad ämnesomsättning priser12,13. Sådan cellulära biologisk komplexitet kan ses som, ‘helheten är större än summan av dess delar’, dvs mitokondrier kan visa olika metabola priser inom en komplex cell jämfört med deras ämnesomsättning när isolerade.
När celler kan erbjuda en bättre OCR-avläsning än isolerade mitokondrier, förloras cell till cell kommunikation inom ramen av en hela vävnad. Exempelvis i hjärnan är den metaboliska aktiviteten av nervceller starkt beroende av den metaboliska aktiviteten av närliggande glialceller14. Som sådan, kan om inrättande av nya tekniker för att undersöka OCR i hela vävnad eller hela organismer bevisa mer insiktsfulla för debut och progression av olika sjukdomar.
Nyligen, nya tekniker har dykt upp för att hantera dessa frågor och möjliggöra mätning av OCR från hela vävnad, segment eller levande organismer. Till exempel rapporterade ett senare arbete syre mätning från en skalbagge flyg muskel med en permeabilized fiber metod med en respirometer15. Nya maskiner för mikro-respiration möjliggör mätning av OCR Langerhanska16,17. Följaktligen har det rapporterats att denna teknik möjliggör mätning av OCR från hela maskar18 och zebrafisk19. Förekomsten av mag barriären kan dock innebära en utmaning för att testa olika droger i samband med OCR förändringar. Intressant, har senaste rapporter av Neville och kollegor visat en ny teknik för att mäta enstaka drosophila larv hjärnan med de väl platta20,21.
I denna studie har vi använt en liknande setup för att möjliggöra mätning av hela OCR från hela levande och icke-mobila Drosophila22. Denna teknik erbjuder också en sekundär fördel i mäta effekterna av olika droger på metabolisk aktivitet i en hel segment, utan att behöva passera genom matsmältningssystemet barriär13,22. Det visades till exempel tidigare som direktinsprutning av lysin histondeacetylas hämmare (KDACi), en drog trodde för att ändra epigenetisk mekanism i hjärnan, resulterade i en förbättrad minnen bildandet23. Men genom att använda vår ny teknik, upptäckte vi att KDAC hämning resulterade i en snabb ökning av OCR, som kan vara en bidragande faktor av sig själv i neuronala aktiviteten. Våra protokoll ger en enkel och ny metod för att bedöma effekterna av olika droger, genetisk manipulation eller fysiologiska påstår (sjukdom, åldrande) på OCR i samband med en hela huvudet.
Vår nya teknik erbjuder en ny metod för att studera metaboliska förändringar i åldrande och sjukdom i samband med hela flyga head segment22. Metoden kan också vara lämpade för att studera effekterna av KDAC natrium butyrate på syreförbrukning. Som vi har visat, leda lysin deacetlyase hämmare (HDAC/KDACs) till OCR förändringar. I huvudsak, som målen i sådana hämmare normalt inte är lokaliserade i mitokondrierna (dessa hämmare inte påverkar klass III deacetylases, sirtuiner)24, sådana droger kunde endast testas på en minst vävnad nivå. Ja, olika läkemedel injiceras direkt till hjärnan, sätt kringgå möjligt bearbetning och modifiering/inaktivering av matsmältningssystemet. Vår teknik erbjuder roman inblick i hur sådana droger direkt inverkan segmentet huvud.
I området i närheten finns det flera kritiska steg. Först, som anges i protokollet, rekommenderar vi förbereder en platta under en timme, med två par händer förbereda plattan. Från vår erfarenhet är kvalitet och stabilitet av OCR mätningar bättre när förberedd i god tid. När du tar för lång tid, ökar förekomsten av låga OCR förtärande brunnar samt kortare stabil OCR. Andra, det är viktigt att utföra en kvalitetskontroll och säkerställa att de experimentella förhållandena mellan olika prover är liknande (pH, syrenivåer). Slutligen, ett kritiskt steg är att välja de rätta algoritmen för att analysera proven. Som vi har visat, gav AKOS standardalgoritmen en missvisande och ibland motsatta beräkning i prover som förbrukas syre vid höga13. Därför betonar vi vikten av att kontrollera rådata för syrehalten och jämföra den resulterande OCR.
För närvarande finns det flera begränsningar med denna teknik. Vid rumstemperatur, apparaten värms upp till 31 ° C (detta är minimal mäta temperaturen medan maskinen är vid rumstemperatur), som kan representera ett stress tillstånd för flyga huvuden25. Detta kan dock lösas genom att placera maskinen i ett kallt rum, som kommer att möjliggöra mätningar vid 25 ° C och därmed utan ett möjligt värmestress att flyga huvuden. Färsk rapport har visat att placera maskinen på 11 ° C, vilket möjliggör OCR inspelningen av flugor vid 25 ° C21. Flyga huvud separation bör dock utföras vid rumstemperatur. Dessutom temperaturvariationer gör det utmanande att kontrollera pH-förändringar och därför rekommenderas det starkt att testa effekterna av fysiologiska villkor/droger på OCR med hjälp av liknande försöksuppställningar. Dessutom har bidrag syreförbrukning genom icke-mitokondrie-oberoende mekanismer ännu inte etablerade26. Genom att använda olika respiratoriska hämmare som är effektiva i att flyga huvuden, skulle det vara möjligt att upprätta sådana icke-mitokondriell syre förbrukning.
Det är anmärkningsvärt att olika däggdjur sjukdomar kännetecknas av förändringar i energimetabolism. Bland dem sjukdomar som kännetecknas av antingen metabola minskning såsom Alzheimers sjukdom eller metabolisk omkoppling såsom cancer. Intressant, används KDAC-hämmare för både Alzheimers sjukdom och cancer behandling27. Medan de exakta mekanismer genom vilka KDAC hämmare uppnår den terapeutiska aspekten förblir oklart, stöder data från vår teknik roman uppfattningen att sådana hämmare kan modulera metabolism.
Sammanfattningsvis är denna metod värdefulla för mäta övergripande syreförbrukning i vivo och mer exakt visar läkemedelseffekter på allmänna metabolism, som kan förbises i isolerade mitokondrier protokoll12. Resultat från denna metod, snarare än tidigare tekniker, har exempelvis inblandade nya insikter för ålder-associerade metabola stelhet vid KDAC behandling. Medan ytterligare arbete krävs för att optimera de experimentella villkor för flyga huvuden, kombinationen av vår teknik och lämplig analys kan leda till ytterligare klargörande av de mitokondriell aktiviteten inom ramen för hela levande vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Andreas Ladurner, Carla Margulis och deras team för omfattande experimentellt stöd. Vi tackar Caitlin Ondracek för hennes synpunkter på manuskriptet. Vi vill tacka Sofia Vikstrom för att hjälpa oss att etablera tidiga faser av denna teknik. Vi tackar också kan Sanderhoff hennes teknisk hjälp. LB finansieras av den tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (Infrafrontier grant 01KX1012). SP har finansierats av en AXA forskningsfond postdoktorsstipendium och NSFC (licensnummer 81870900). AVV finansieras av QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |