במאמר זה נדגים איך מתבצעת טכניקת microbiopsy סופג ו איך המדגם יכולים לשמש לחילוץ RNA לדיגום סימולטני ופשוט של עור ודם בצורה פולשנית.
הניגודי קונבנציונאלי מגביל את מחקר קליני המערבת האזורים הרגישים קוסמטית או יישומים בילדים בגלל invasiveness שלה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לשימוש של המכשיר סופג מבוסס microneedle,. microbiopsy ספיגה, לדיגום פולשנית של תערובת עור ודם. המטרה שלנו היא לעזור להקל על ההתקדמות המהירה במחקר קליני, הקמתה של סמנים ביולוגיים עבור מחלת העור והפחתת הסיכון למשתתפי מחקר קליני. בניגוד קונבנציונאלי העור ביופסיה טכניקות, microbiopsy סופג יכולה להתבצע תוך שניות, אינו דורש אימונים אינטנסיביים בשל העיצוב הפשוט שלו. בדו ח זה, אנו מתארים את השימוש microbiopsy סופג, כולל וטעינה של יישום, מתנדב. לאחר מכן, אנו מראים כיצד לבודד RNA מדגם נספג. לבסוף, נדגים את השימוש שעתוק במהופך כמותיים PCR (RT-qPCR) לכמת mRNA רמות הביטוי של דם (CD3E ו- CD19) וגם העור (KRT14 ו- TYR). השיטות אנו מתארים לנצל את המדף ערכות של ריאגנטים. פרוטוקול זה מציע בגישה פולשנית לדיגום סימולטני של עור ודם בתוך המטריצה microbiopsy בולע אותו. מצאנו ועדות האתיקה של האדם, קלינאים ומתנדבים לתמוך בגישה זו דרמטולוגיים למחקר.
העור ביופסיה היא אחת מהטכניקות החיוניים ביותר בדרמטולוגיה לדיגום העור ואבחון עוקבות של מחלות עור באמצעות הערכת histopathological. הטכניקה ביופסיה כרוכה רפואי מקצועי באמצעות ביופסיה להב או אגרוף כדי להסיר את הנגע חשוד על עור המטופל בדיקה1. על פי הטכניקה היא יעילה, היא פולשני ביותר, מגביל מחקר קליני כמו נקודת הקצה בדרך כלל כרוך ביולוגיה מולקולרית טכניקות2,3. ניתוח מולקולריים של מחלות עור יש פוטנציאל לספק מידע ביולוגי ספציפי מאוד כי ניתוח histopathological יכול, ובכך להקל על סמים גילוי של מחלה אבחון4,5. חוץ מזה, הדרישה מדגם בטכניקות מולקולריות ביותר הוא קטן יחסית עשוי להוביל לירידה בשימוש בבעלי חיים ואת היתר מספר גדול יותר של משכפל. לכן ברור הצורך טכניקה חלופית מאפשרת ניתוח מולקולרית במחקר קליני, מוריד את הסיכון עבור המשתתפים.
כדי לטפל כזה צורך בשטח, פיתחה הקבוצה שלנו עם הפלטפורמה האבחון מבוססת microneedle הרומן, microbiopsy סופג, המאפשר איסוף כמות זעירה של העור מעורב בדם בצורה פשוטה ולא פולשנית6. מטרת הפרסום היא לתאר את. microbiopsy ספיגה ככלי הדגימה כדי להקל על אנליזה מולקולרית באמצעות החילוץ-RNA במחקר קליני.
בעבר, תארנו את הגרסה הראשונה של microbiopsy, microbiopsy עור, אשר מורכב microneedle של עיצוב תלת שכבתי פלדה כדי לחלץ חתיכות קטנות של רקמות העור7. החידוש של התקן זה נובע בנקודות המגע מרובים מ- microneedle המתיר רקמות יעיל חילוץ3. לעומת זאת, ביופסיה ניקוב עור עגול מספק נקודת קשר אחד בלבד, פשוט קורע את העור ללא לכידת דוגמה במקרים מסוימים. בהתבסס על microbiopsy העור, פיתחנו לאחרונה את microbiopsy ספיגה אשר יש דם ועור הדגימה יכולות. המכשיר הוכח להיות ריאלי עבור שימוש באזורים משאב מסכן המחקר אפידמיולוגיים האחרונות6.
בשל העיצוב הפשוט שלו,. microbiopsy ספיגה יכול להתבצע תוך כמה שניות, אינה דורשת הכשרה נרחבת. בנוסף, הרדמה מקומית אינה דרושה, האפליקציות באתר אינו גורם הצטלקות. בפרוטוקול הנוכחי מאפשר חוקרים או אנשי מקצוע רפואיים ללא רלוונטי דגימה אימון להשגת עור יישוב נתונים, לצורך ניתוחם מולקולרית. אנו מצפים microsampling התקנים להיות שגרתי במחקר העור בעתיד.
למרות microbiopsy שדווח במחקרים אחרים מחלות עור מעורבים טכניקות אבחון מולקולריות6,8,9,10, כגון נגיף הפפילומה האנושי זיהוי ה-DNA, פרוטוקול זה הוא הראשון כדי להדגים את הפרטים של דוגמת הפקת ועיבוד טכניקות. microbiopsy ספיגה. יתר על כן, זהו הדוח הראשון המתאר את פרופיל ביטוי גנטי היחסי של העור, בתאי הדם בדגימות microbiopsy.
תוצאות אלו מדגימים כי. microbiopsy ספיגה יכול לשמש ככלי עבור הדגימה פשוטה ולא פולשנית של תערובת עור ודם על אפיון מולקולרי. יישום התקן לפי הפרוטוקול שלנו חיוני להשגת תוצאות אמינות כפי שמוצג על ידי ההבדל בכמות ה-RNA התאוששה עם יישומים שונים פרוטוקולים (איור 3). ברגע המדגם מופק, הדגימה הבאים עיבוד שלב לחילוץ RNA דומה מאוד פרוטוקולים הוקמה15,16. חוץ מזה מן השלבים הראשונים ב- RNA החילוץ ששונו עבור. microbiopsy ספיגה, שינוי מפתח נוסף הוא השימוש במים נטולי RNase כדי לשפר את התוצאות עבור יישומים במורד הזרם. יתר על כן, ראוי להזכיר כי הגן הפניה השתמשו במחקר זה הוא RPLP0. RPLP0, שתפקידם הוא נודע בזכות תאים שונים, סוגי רקמות17, דווחה גנים התייחסות מתאימה לשימוש עור שאינו מלנומה סרטן נגעים טרום סרטניים18.
אחת המגבלות העיקריות של המכשיר היא הסרת microbiopsy של המכשיר, אשר גוזלת זמן, פוטנציאל מגדילה את הסיכוי לאובדן לדוגמה, במיוחד עבור דגימות רגיש כמו ה-RNA. למרות זאת, הסוגיה ניתן להתגבר על ידי קירור קדם כל הכלים לעיבוד סטרילי, כגון צינורות microcentrifuge 2 מ”ל, על קרח יבש.
השימוש. microbiopsy ספיגה הוא פשוט, לא דורשת אימונים אינטנסיביים. ביופסיה הקונבנציונלית אינה הכרחית כמו microbiopsy מאפשרת אפיון מולקולרי עם טכניקות אבחון מולקולרי הוקמה, כגון RT-qPCR. עוד יותר לכמת, להפגין את יכולת דגימה של. microbiopsy ספיגה, נחקר ספרות הקודם מעורבים החילוץ-RNA מרקמות העור האנושי. ממעטפת טיפוסי 3.0 או 4.0 מ”מ אגרוף ביופסיה, שלושה מחקרים דיווחו על הכמויות RNA שחולצו נע בין 50 ל-200 ng לכל מ”ג של העור רקמות19,20,21. השוואת 1.43 נג של RNA אשר התאושש את. microbiopsy ספיגה בממוצע (איור 3), המשקל של רקמות העור שנדגמו צפוי טווח של 0.29-115 µg המבוססים על היחס RNA לרקמות באותו ממחקרים ביופסיה של העור אגרוף.
פרוטוקול זה אינה ללא מוקשים פוטנציאליים, אם כי חלק מהבעיות בקלות ניתן להתגבר. לדוגמה, הנתונים החילוץ RNA הציע וריאציה ניכרת אפילו עם הזמן 10-s אחזקות (איור 3). כדי לטפל בבעיה, פתרון פוטנציאלי אחד כולל אופטימיזציה של פרוטוקול יישום. פרמטרים כגון כוח נמרח על העור, מחזיק זמן צריך להיות נבדק אופטימיזציה להקטנת הווריאציות מדגם החילוץ. הנושא פוטנציאליים אחרים הוא הסרת microbiopsy של המכשיר, אשר עשוי להשפיע את מדגם ובטחונו לשחזור. למרות הסרת את microbiopsy לחילוץ RNA היא גישה יעילה, כל תהליך מייגע, הדגימה עלולה להיחשף לזיהום בתהליך. לכן, השינוי של פרוטוקול עיבוד הדגימה רצוי מאוד כדי להבטיח שלמות הדגימה ולמנוע אובדן הדגימה.
לאחר שני הנושאים לעיל מטופלות, צפוי כי המכשיר יהיה כלי תקני למחקר קליני. חשוב לשים לב כי המכשיר לוכד דגימת עור ודם בו זמנית, זה צריך לקחת בחשבון בעת ניתוח הנתונים ביטוי גנים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את הפרטים של ביצוע microbiopsy סופג ככלי קל ולא פולשנית עור משולב, לקיחת דמים, הדגימה הבאים עיבוד פרופיל ביטוי גנטי היחסי.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות NHMRC מלגות APP1109749 ו- APP1111216, אוניברסיטת קווינסלנד סנטניאל מלגה, מלגת מחקר לתארים מתקדמים הבינלאומי.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |