في هذه المقالة، نظهر كيف يتم تنفيذ هذا الأسلوب ميكروبيوبسي ماصة، وكيف يمكن استخدام العينة لاستخراج الحمض النووي الريبي لأخذ عينات بسيطة والمتزامن للجلد والدم بطريقة كسبها.
خزعة الجلد التقليدية تحد من البحوث السريرية التي تشمل المناطق الحساسة تجميلي أو تطبيقات طب الأطفال نظراً لما اختزاع. هنا، نحن تصف البروتوكول المتعلق باستخدام ماصة الجهاز القائم على ميكرونيدلي، ميكروبيوبسي ماصة، لكسبها لأخذ العينات من الخليط الجلد والدم. هدفنا هو المساعدة في تيسير إحراز تقدم سريع في البحوث السريرية، وإنشاء للمؤشرات الحيوية لأمراض الجلد والحد من الخطر للمشاركين في البحوث السريرية. وعلى النقيض من التقنيات خزعة الجلد التقليدية، ميكروبيوبسي ماصة يمكن تنفيذها في غضون ثوان ولا تتطلب تدريبا مكثفا نظراً لتصميمها بسيط. في هذا التقرير، يصف لنا استخدام ماصة ميكروبيوبسي، بما في ذلك تحميل وتطبيقها، وعلى متطوع. بعد ذلك، نعرض كيفية عزل الحمض النووي الريبي من العينة استيعابها. وأخيراً، نحن شرح استخدام النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) لقياس مستويات التعبير مرناً للدم (CD3E و CD19) والجلد (KRT14 و صور). الاستفادة من الأساليب التي يمكننا وصف قبالة الجرف مجموعات المواد والمواد الكاشفة. ويوفر هذا البروتوكول نهجاً كسبها لأخذ العينات متزامنة من الجلد والدم داخل المصفوفة ميكروبيوبسي ماصة نفس. وقد وجدنا لجان الأخلاقيات البشرية والأطباء والمتطوعين تكون داعمة لهذا النهج في بحوث الأمراض الجلدية.
خزعة الجلد هو أحد الأساليب الأكثر أهمية في الأمراض الجلدية لأخذ عينات الجلد وتشخيص الأمراض الجلدية من خلال تقييم نسيجية لاحقة. الأسلوب خزعة الذي ينطوي على استخدام خزعة بليد أو لكمه لإزالة الآفة المشبوهة على جلد المريض لفحص1مهنية طبية. على الرغم من التقنية فعالة، هو الغاية الغازية ويحد البحوث السريرية ونقطة النهاية ينطوي عادة على تقنيات البيولوجيا الجزيئية2،3. التحليل الجزيئي للأمراض الجلدية لديها القدرة على توفير معلومات بيولوجية محددة للغاية أن يتعذر تحليل نسيجية، مما ييسر المخدرات الاكتشاف والمرض التشخيص4،5. إلى جانب ذلك، نموذج الطلب في التقنيات الجزيئية الأكثر صغير نسبيا وقد تؤدي إلى الحد من استخدام الحيوانات والسماح بعدد أكبر من replicates. ولذلك، هناك واضحة تحتاج لأسلوب بديلة التي تمكن التحليل الجزيئي في البحوث السريرية ويقلل من المخاطر للمشاركين.
لمعالجة هذه حاجة في هذا المجال، وضعت مجموعتنا رواية منصة التشخيص القائم على ميكرونيدلي، ميكروبيوبسي ماصة، التي تمكن من جمع كمية صغيرة من الجلد مختلطة مع الدم ب طريقة بسيطة وكسبها6. والغرض من هذا المنشور وصف ميكروبيوبسي ماصة كأداة لأخذ عينات لتسهيل التحليل الجزيئي عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي في البحوث السريرية.
سابقا، لقد قمنا بوصف النسخة الأولى من ميكروبيوبسي، ميكروبيوبسي الجلد، الذي يتكون من ميكرونيدلي من تصميم ثلاثة طبقة ألواح الصلب لاستخراج قطعة صغيرة من أنسجة الجلد7. ويأتي حداثة هذا الجهاز من نقاط اتصال متعددة من ميكرونيدلي تسمح الأنسجة كفاءة استخراج3. وفي المقابل، خزعة جلد دائرية لكمه يوفر نقطة اتصال واحدة فقط ودموع الجلد ببساطة دون التقاط أي نموذج في بعض الحالات. استناداً إلى ميكروبيوبسي الجلد، وضعنا مؤخرا ميكروبيوبسي ماصة الدم والجلد أخذ عينات من قدرات. ثبت الجهاز يكون قابلاً للاستخدام في المناطق الفقيرة بالموارد في دراسة وبائية الأخيرة6.
نظراً لتصميمها بسيط، ميكروبيوبسي ماصة يمكن تنفيذها في غضون ثوان قليلة، ولا تتطلب تدريبا مكثفا. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك حاجة إلى مخدر موضعي، وموقع التطبيق لا يسبب تندب. ويتيح هذا البروتوكول الباحثين أو أصحاب المهن الطبية دون أخذ العينات ذات الصلة التدريب للحصول على البيانات الجلد المستهدف للتحليل الجزيئي. أننا نتوقع من الأجهزة ميكروسامبلينج تصبح روتينية في بحوث الجلد في المستقبل.
على الرغم من ميكروبيوبسي أبلغ في دراسات أخرى أمراض الجلد التي تنطوي على تقنيات التشخيص الجزيئي6،،من89،10، مثل فيروس الورم الحليمي البشري اكتشاف الحمض النووي، هذا البروتوكول هو الأول لإظهار تفاصيل تقنيات استخراج وتجهيز العينة ميكروبيوبسي ماصة. علاوة على ذلك، وهذا هو أول تقرير يصف التنميط التعبير الجيني النسبي للجلد وخلايا الدم في عينات ميكروبيوبسي.
وتبين هذه النتائج أن ميكروبيوبسي ماصة يمكن استخدامها كأداة لأخذ عينات بسيطة وكسبها من الجلد والدم مخلوط للتوصيف الجزيئي. تطبيق الجهاز وفقا للبروتوكول لدينا أمر ضروري للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها كما هو موضح بالفرق في الجيش الملكي النيبالي المبلغ المسترد مع تطبيق مختلف البروتوكولات (الشكل 3). حالما يتم استخراج العينة، تكون العينة اللاحقة تجهيز خطوة لاستخراج الحمض النووي الريبي مماثل جداً للبروتوكولات المعمول بها15،16. إلى جانب ذلك هو تغيير رئيسي آخر من الخطوات الأولية في استخراج الحمض النووي الريبي التي يتم تعديلها ميكروبيوبسي ماصة، استخدام المياه خالية من رناسي لتحسين النتائج للتطبيقات المتلقين للمعلومات. وعلاوة على ذلك، فمن الجدير بالذكر أن الجين المرجعية المستخدمة في هذه الدراسة هو RPLP0. ذكر RPLP0، وظيفتها معروف جيدا لخلية مختلفة و أنواع الأنسجة17، كجينات مرجعية مناسبة للاستخدام في سرطانات الجلد غير الميلانوما وأورام18.
أحد القيود الرئيسية للجهاز هو إزالة ميكروبيوبسي من الجهاز، والتي تستغرق وقتاً طويلاً، ويحتمل أن يزيد من فرصة لفقدان عينة، خاصة بالنسبة للعينات الحساسة مثل الجيش الملكي النيبالي. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه المسألة بالتبريد قبل جميع أدوات المعالجة العقيمة، مثل أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل، على الثلج الجاف.
استخدام ميكروبيوبسي ماصة بسيطة ولا تتطلب تدريبا مكثفا. خزعة التقليدية ليس من الضروري كما يسمح ميكروبيوبسي التوصيف الجزيئي مع تقنيات التشخيص الجزيئي المنشأة، مثل الرايت qPCR. كذلك قياس وإثبات قدرته أخذ العينات من ميكروبيوبسي ماصة، تم التحقيق في المؤلفات السابقة التي تنطوي على استخراج الحمض النووي الريبي من أنسجة جلد الإنسان. من جلد ملم نموذجي 3.0 أو 4.0 لكمه خزعة، أفادت ثلاث دراسات الحمض النووي الريبي المستخرج المبالغ تتراوح من 50 إلى 200 نانوغرام كل مغ من الجلد الأنسجة19،،من2021. مقارنة مع 1.43 الحرس الوطني للجيش الملكي النيبالي الذي تم استرداده من ميكروبيوبسي ماصة على وزن الجلد عينات الأنسجة في المتوسط (الشكل 3)، من المتوقع أن مجموعة من 0.29-115 ميكروغرام استناداً إلى نفس نسبة الحمض النووي الريبي للأنسجة من دراسات خزعة لكمه الجلد.
هذا البروتوكول لا تخلو من المزالق المحتملة، على الرغم من أن بعض المشاكل يمكن التغلب عليها بسهولة. على سبيل المثال، اقترح البيانات استخراج الحمض النووي الريبي تباين كبير حتى مع الوقت عقد 10-s (الشكل 3). لمعالجة هذه المشكلة، ينطوي أحد الحلول المحتملة على الاستفادة المثلى من بروتوكول التطبيق. معلمات مثل القوة المطبقة على الجلد وينبغي اختبار زمن الاحتباس والأمثل للحد من التباينات في استخراج عينة. والمسألة الأخرى المحتملة هي إزالة ميكروبيوبسي من الجهاز، والتي قد تؤثر على سلامة العينة والانتعاش. على الرغم من أن إزالة ميكروبيوبسي لاستخراج الحمض النووي الريبي نهج فعال، الإجراء بأكمله مملة، والعينة قد يكون عرضه للتلوث في هذه العملية. ولذلك هو الغاية المطلوب تعديل البروتوكول تجهيز العينة بغية ضمان سلامة العينة والحيلولة دون فقدان عينة.
متى يتم تناول المسألتين أعلاه، فمن المتوقع أن الجهاز سوف تصبح أداة قياسية للبحوث السريرية. من المهم أن نلاحظ أن يلتقط الجهاز عينة الجلد والدم في وقت واحد، وهذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تحليل البيانات التعبير الجيني. وفي الختام، هذا البروتوكول وصف تفاصيل أداء ميكروبيوبسي ماصة كأداة سهلة وكسبها للعينة اللاحقة التجهيز للتنميط التعبير الجيني النسبي وأخذ عينات من الدم والجلد مجتمعة.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نعترف بتمويل المنح الدراسية APP1109749 و APP1111216، ومنحة العيد المئوي لجامعة كوينزلاند ومنحة أبحاث الدراسات العليا الدولية.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |