Dit artikel biedt een efficiënt en haalbaar methode voor de opbouw van meerdere lagen stamcel bladen met de cel van de stam van de gunstige eigenschap.
Stamcel therapie toont een veelbelovende toekomst in het regenereren van de benadeelde orgel en weefsels, en de cel blad techniek is ontwikkeld ter verbetering van het lage cel retentie en de overleving van de arme binnen de doelzone. Echter tijdens het bouwproces in vitro , is een oplossing voor het behoud van de stamcel topicale en verhoging van het bedrag van de cel binnen de cellaag dringend nodig. Dit protocol presenteert hier een methode voor de bouw van een meerdere lagen cellaag met gunstige stamcel topicale en optimale bruikbaarheid. Decellularized varkens hartzakje (DPP) wordt bereid door fosfolipase een methode decellularization2 (PLA2) als de cel blad steiger en rat beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSCs) zijn geïsoleerd en uitgebreid als de geplaatste cellen. De tijdelijke meerdere lagen blad celstructuur is gebouwd met behulp van RAD16-ik peptide hydrogel. Tot slot, de cellaag is gekweekt met een dynamische perfusie-systeem te stabiliseren van de driedimensionale (3D) structuur en de cellaag kon worden verkregen na een 48-urige cultuur in vitro. Dit protocol biedt een efficiënt en haalbaar methode voor de bouw van een vel met meerdere lagen cel van de stam en het blad van de cel kan worden ontwikkeld als een gunstige stamcel therapie product in de toekomst.
Stamcel therapie werd gerapporteerd als een effectieve behandeling voor vele ziekten; lage cel retentie en arme overleven binnen de doelzone blijven echter kritieke problemen na injectie van de traditionele cel van de stam. U kunt dit probleem oplossen, ontwikkeld weefsel engineering wetenschappers de cel blad techniek. Een monolayered cellaag met intact extracellulaire matrix bereid was om te beginnen met behulp van de temperatuur-respons cultuur schotel1, en haar follow-up studies rapporteerde de significante verbeteringen van de stamcel retentie en overleven in de infarcted gebied2,3. Onder de werd bouw van de meerdere lagen cellaag gerapporteerd als een doeltreffende strategie ter verbetering van de overleving van de cel en de cel blad therapeutisch effect3,4. Sindsdien hebben wetenschappers gewerkt aan andere cel blad bouwmethoden te ontwikkelen teneinde het bedrag van de cel, stamcel eigenschap en mechanische eigenschap van de bladen van de cel. Tot nu toe, bepaalde soorten cellaag zijn gebouwd en studeerde bij de behandeling van myocardinfarct5,6van de schade van kraakbeen, en huid wond7.
De topicale van stamcellen voor transplantatie toonde een opkomende invloed op benadeelde Weefselregeneratie en andere cel blad bouw strategieën hebben verschillende effecten op de cellen van de stam. Aan de ene kant confluente cel bladen alleen bestond uit high-density stamcellen en natuurlijke extracellulaire matrices kunnen worden verworven door stapelen monolayered cel bladen8 of met behulp van magnetische weefsel engineering technieken9. Aan de andere kant, ontwikkelde onderzoekers verschillende steigers voldoende mechanische sterkte te en te ondersteunen cel groei10,11,12, waardoor een laag stamcel dichtheid om ervoor te zorgen de voeding zaaien aanbod. Echter, ondanks deze benaderingen, de lage efficiënte voeding levering binnen de meerdere lagen celstructuur blad blijft een groot probleem tijdens de bouw in vitro . Dus is een bouwsysteem van efficiënt en haalbaar cel blad dringend noodzakelijk.
Dit protocol beschrijft de stappen ter voorbereiding van de cellaag van een multilayeredmesenchymal-cel van de stam (MSC). In dit bouwsysteem, wordt het blad van de mechanische sterkte van cel verzorgd door een DPP. Op basis van deze steiger, de 3D celstructuur kan worden snel geconstrueerd met RAD16-ik peptide hydrogel, en een dynamische perfusie-systeem wordt gebruikt voor de cultuur van de meerdere lagen cellaag, om te stabiliseren van de 3D blad celstructuur en voldoende voeding aanbod voor de cellen. Met behulp van dit systeem, een meerdere lagen BMSC blad met succes werd voorbereid en een optimaal therapeutisch effect op de rat myocardiaal infarct model13tentoongesteld.
Dit protocol rapporteert een efficiënte methode voor de bouw van een meerdere lagen MSC blad. Deze cellaag vertoont optimale mechanische sterkte, hoge celdichtheid seeding en gunstige stamcel topicale. BMSCs als een voorbeeld gebruikt, is de 3D celstructuur snel gebouwd met RAD16-ik peptide hydrogel. Na wordt gekweekt in het dynamische perfusie-systeem, het meerdere lagen BMSC blad met succes wordt verkregen en de BMSCs handhaven een hoog expressie van markeringen in een cel van de stam.
Bouw…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nummer 31771064); de wetenschap en de technologie Planning Project van de provincie Guangdong (subsidie nummers 2013B010404030, 2014A010105029 en 2016A020214012); de wetenschap en de technologie Planning Project van Guangzhou (subsidie nummer 201607010063); en de Undergraduate innovatie en ondernemerschap trainingsprogramma (subsidie nummer 201610559028); de National Science Foundation voor jonge wetenschappers van China (verlenen nummer 31800819).
Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
EP tube | Axygen | 31617934 | |
Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
Pura Matrix | BD | 354250 | |
Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |