Identificação de codificação e Classes de RNA não-codificante expressa em suínos, sangue total
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para o processamento de codificação (mRNA) e não-codificantes (ncRNA) globina reduzido RNA-seq bibliotecas de uma amostra da unidade de sangue total.
Abstract
O advento da inovadora e cada vez mais poderosas técnicas de sequenciamento próxima geração abriu novos caminhos para a capacidade de examinar a expressão de gene subjacente relacionada a processos biológicos de interesse. Essas inovações não só permitem que os pesquisadores a observar a expressão das sequências de mRNA que codificam genes essa função celular do efeito, mas também as moléculas de RNA (ncRNA) não-codificantes que permanecem untranslated, mas ainda têm funções reguladoras. Embora os pesquisadores têm a capacidade de observar a expressão tanto do mRNA e ncRNA, tem sido habitual para um estudo para se concentrar em um ou outro. No entanto, quando estudos estão interessados na expressão tanto do mRNA e ncRNA, muitas vezes eles usam amostras separadas para examinar ou codificação ou não-codificantes RNAs devido à diferença de preparações de biblioteca. Isso pode levar à necessidade de mais amostras que pode aumentar o tempo, consumíveis e estresse animal. Além disso, pode causar pesquisadores decidir para preparar amostras para análise de apenas um, geralmente o mRNA, limitando o número de questões biológicas que podem ser investigados. No entanto, ncRNAs abrangem várias classes com funções reguladoras aquela expressão de RNAm de efeito. Porque ncRNA são importantes para processos biológicos fundamentais e desordem destes processos em durante a infecção, eles podem, portanto, possam ser alvos para terapêutica. Este manuscrito demonstra um protocolo modificado para a geração do mRNA e não-codificantes do RNA expressão bibliotecas, incluindo o RNA viral, de uma única amostra de sangue total. Otimização do presente protocolo, melhorou a pureza do RNA, aumentou a ligadura para recuperação de RNAs metilados e omitido a seleção de tamanho, para permitir a captura de mais espécies de RNA.
Introduction
Sequenciamento de próxima geração (NGS) emergiu como uma poderosa ferramenta para a investigação das alterações que ocorrem no nível genômico de organismos biológicos. Preparação da amostra para métodos NGS pode variar dependendo do organismo, tipo de tecido, e mais importante as perguntas os pesquisadores fazem questão de endereço. Muitos estudos se voltaram para NGS como um meio de estudar as diferenças na expressão do gene entre Estados como indivíduos sãos e doentes,1,2,3,4. O sequenciamento tomar lugar numa base de genoma inteiro e permite que um pesquisador capturar a maioria, se não todos, a informação genômica para um marcador genético específico cada vez apontam.
Os marcadores mais comuns de expressão observadas são os RNAs mensageiro (mRNAs). Os procedimentos mais utilizados para preparar as bibliotecas para RNA-seq são otimizados para a recuperação das moléculas de mRNA através do uso de uma série de purificações, fragmentações e ligadura5,6. No entanto, a decisão sobre como um protocolo é para ser realizado depende muito do tipo de amostra e as questões sendo colocadas sobre amostra disse. Na maioria dos casos, o RNA total é extraído; ainda, nem todas as moléculas de RNA são de interesse e em casos tais como estudos de expressão de RNAm excessivamente abundantes espécies de RNA, como RNA ribossómico (rRNA) precisam ser removidos para aumentar o número de transcrições detectáveis associado com os mRNAs. O método mais popular e amplamente utilizado para a remoção das moléculas de RNA ribossomal abundante é a redução do polyadenylated RNA transcrições referidas como polyA depleção7. Essa abordagem funciona bem para a análise da expressão do mRNA como não afeta as transcrições do mRNA. No entanto, em estudos que estão interessados em RNAs virais ou não-codificantes, polyA depleção também remove essas moléculas.
Muitos estudos optar por focar a preparação de biblioteca de sequência de RNA para examinar qualquer expressão de RNAm (codificação) ou uma determinada classe de RNA não-codificante de pequena ou grande. Apesar de existirem outros procedimentos8 como a nossa que permitem a preparação da amostra dupla, muitos estudos preparem bibliotecas de amostras separadas para estudos separados quando disponível. Para um estudo como o nosso, isso normalmente exigiria várias amostras de sangue, aumentando o tempo, consumíveis e estresse animal. O objetivo do nosso estudo era ser capaz de usar todo o sangue de animais para identificar e quantificar as diferentes classes de ambos mRNA e RNA não-codificante expressas entre saudável e altamente patogénica reprodutiva suína e o vírus da síndrome respiratória (HP-PRRSV) desafiou os porcos9,10 , apesar de ter apenas uma unidade de sangue total de amostra (2,5 mL) de cada porco. Para isso, precisávamos para otimizar a extração típica e protocolos de criação de biblioteca para gerar os dados apropriados para permitir a análise de mRNA e não-codificantes do RNA (ncRNA) expressão11 de uma única amostra.
Isto levou a uma necessidade de um protocolo que permitiu mRNA e a análise de RNA não-codificante porque os kits de padrão disponíveis e métodos para criação de biblioteca e extração de RNA-destinavam-se principalmente para mRNA e usam uma depleção de poli-A etapa12. Esta etapa que tornaram impossível recuperar de RNA não-codificante ou transcrições virais da amostra. Portanto, um método otimizado era necessário que permitido para extração de RNA total sem esgotamento de polyA amostra. O método apresentado neste manuscrito foi otimizado para permitir o uso de sangue como um tipo de amostra e construir bibliotecas de sequenciamento para mRNA e ncRNAs de tamanhos pequenos e grandes. O método foi otimizado para permitir a análise de todos os RNAs detectáveis não-codificantes, bem como reter RNAs virais para posterior investigação13. Ao todo, nosso protocolo de preparação de biblioteca otimizado permite para a investigação de várias moléculas de RNA de uma amostra da unidade de sangue total.
O objetivo geral por trás o uso desse método foi desenvolver um processo que permitiu para a coleção de não-codificantes do RNA e mRNA de uma amostra de sangue total. Isto nos permite ter mRNA, ncRNA e RNA viral para cada animal em nosso estudo, originário de uma única amostra9. Isto, em última análise, permite a descoberta científica mais sem custos adicionais de animais e dá uma imagem mais completa da expressão de cada amostra individual. O método descrito permite o exame dos reguladores da expressão gênica, bem como permitindo a conclusão dos estudos correlativos comparando ambos mRNA e expressão de RNA não-codificante usando uma amostra da unidade de sangue total. Nosso estudo utilizou este protocolo para examinar as alterações na expressão gênica e possíveis epigenéticos reguladores em Viralmente infectado comerciais de suínos machos 9 – semana de idade.
Protocol
Representative Results
Discussion
O primeiro passo crítico no protocolo que foi otimizado incluiu as etapas de depleção de globina adicionado, que tornou possível obter leituras de qualidade de amostras de sangue total. Uma das maiores limitações sobre o uso de sangue total em estudos de sequenciamento são o elevado número de leituras na amostra que irão mapear para moléculas de globina e reduzir as leituras que poderiam mapear para outras moléculas de interesse18. Portanto, na otimização do protocolo para o nosso tip…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado principalmente pela pelo USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 e em parte pelo USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Este estudo foi suportado em parte por uma nomeação para o agrícola pesquisa serviço programa de participação de pesquisa administrada pelo Instituto de Oak Ridge para ciência e educação (ORISE) através de um acordo interinstitucional entre o departamento de energia ( DOE) e o departamento de agricultura dos EUA. ORISE é gerido pela Oak Ridge Associated universidades sob contrato DOE não. DE-AC05-06OR2310.
Gostaríamos de agradecer o Dr. Kay Faaberg para os clones HP-PRRSV infecciosos, Dr. Susan Brockmeier por sua ajuda com animais envolvidos no experimento e Sue Ohlendorf para secretariado em preparação do manuscrito.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Referências
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