Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)
Summary
Dieses Protokoll beschreibt das manuelle Sortieren Verfahren, um einzelne Eindringmittel beschrifteten Neuronen, gefolgt von in-vitro- Transkription-basierte mRNA Verstärkung für die hoch-Tiefe einzellige RNA Sequenzierung zu isolieren.
Abstract
Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) ist jetzt ein weit implementierten Werkzeug für die Untersuchung der Genexpression. Handelsübliche einzellige RNA-Sequenzierung Plattformen verarbeiten alle Eingabezellen wahllos. Manchmal wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) stromaufwärts verwendet, um einen speziell gekennzeichneten Bevölkerung von Interesse zu isolieren. Eine Einschränkung des FACS ist die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Eingabezellen mit deutlich beschrifteten Brüche, unpraktisch zum sammeln und Profilerstellung seltene oder spärlich beschrifteten Neuron Populationen aus dem Gehirn der Maus. Hier beschreiben wir eine Methode für manuell sammeln spärlich Eindringmittel mit der Bezeichnung einzelner Neuronen aus frisch Maus Hirngewebe dissoziiert. Dieser Prozess ermöglicht es für die Erfassung mit der Bezeichnung der einzelnen Neuronen mit hoher Reinheit und anschließende Integration mit einer in-vitro- Transkription-basierte Verstärkung Protokoll, die endogene Transkript Verhältnisse bewahrt. Wir beschreiben eine doppelte lineare Verstärkung-Methode, die einzigartige Molekül Bezeichner (UMIs) verwendet, um einzelne mRNA zählt zu generieren. Zwei Runden der Verstärkung ergibt ein hohes Maß an gen-Erkennung pro Einzelzelle.
Introduction
Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) verwandelte transkriptomischen Studien. Während große einzellige RNAseq ausgeführt werden kann, mit einer Vielzahl von Techniken, wie Tropfen1,2, Mikrofluidik3, Nanogrids4und Mikrovertiefungen5, können nicht die meisten Methoden definierte Zelltypen sortieren. genetisch codierte Fluorophore ausdrücken. Um eine wählen Sie die Zellenbevölkerung zu isolieren, wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) häufig verwendet, um markierte Zellen in eine einzelne Zelle Modus zu sortieren. Allerdings FACS hat einige Einschränkungen und erfordert sorgfältige Verarbeitung Beispielschritte. Erstens eine große Anzahl von Eingabezellen sind in der Regel benötigt (oft mehrere Millionen Zellen pro mL), mit einem signifikanten Anteil (> 15 – 20 %) mit der beschrifteten Bevölkerung. Zweitens können Zelle Vorbereitungen erfordern mehrfache Umläufe der Dichte Gradienten Zentrifugation Schritte zum Entfernen von Gliazellen Bruchteil, Schmutz und Zelle-Klumpen, die sonst die Düse oder Flow Zelle verstopfen könnte. Drittens: FACS beschäftigt in der Regel färben und Entfärben Schritte für die lebenden/Toten Färbung (z. B. 4 ‘, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Propidium Jodid (PI) und Cytotracker Farbstoffe), die zusätzliche Zeit in Anspruch nehmen. Viertens: als Faustregel für Zweifarben-Sortierung (z. B. DAPI und grün/rot fluoreszierenden Proteins (GFP/RFP)), in der Regel zwei Proben und ein Steuerelement benötigt werden, erfordern eine unbeschriftete Probe neben die gewünschte Maus Belastung verarbeitet werden. Fünftens ist Filterung oft mehrmals vor und während der Probe zu sortieren, um proaktiv verhindert verstopfte Querprofillinien in ein FACS-Maschine durchgeführt. Sechstens muss Zeit zugeteilt werden, in am häufigsten verwendeten FACS-Setups zu initialisieren und stabilisieren den Fluidstrom und Tröpfchen Kalibrierung durchführen. Siebte, Kontrolle, die Proben in der Regel in der Reihenfolge vor der eigentlichen Probenentnahme Entschädigung Matrizen, Wams Ablehnung einzurichten laufen, Tore, etc. Benutzer entweder führen Sie die Schritte 6 bis 7 sich vorzeitig oder erfordern die Hilfe eines Technikers parallel. Zu guter Letzt Post-FACS, oft gibt es Maßnahmen, um sicherzustellen, dass nur einzelne beschriftet Zellen sind in jede Vertiefung; zum Beispiel durch Überprüfung Proben in einem High-Content-Screening-Setup wie eine schnelle Platte-Imager.
Um die oben beschriebenen Schritte zu umgehen und erleichtern eine relativ schnelle, gezielte Sequenzierung von eine kleine Population von einzelnen Eindringmittel beschrifteten Neuronen, beschreiben wir eine manuelle Sortieren gefolgt von zwei Runden von einem hochsensiblen in-vitro- Verfahren Verstärkung-Protokoll, genannt double in-vitro-Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq). Die RNA-Verstärkung und cDNA-Bibliothek-Generation sind von Eberwine Et al. 6 und Hashimshony Et al. 7, mit bestimmten Modifikationen entsprechend Maus Interneuronen, die kleinere zelluläre Volumen haben; Darüber hinaus haben wir auch gefunden, dass es ebenso nützlich für exzitatorischen pyramidale Neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das manuelle Sortieren Protokoll eignet sich für eine betreute RNA Sequenzierung des Neurons Populationen, die entweder dünn mit der Bezeichnung im Gehirn von Mäusen oder repräsentieren eine seltene Zellpopulation, die sonst nicht möglich ist, mit aktuellen Hochdurchsatz-Zelle zu studieren Sortierung und Verstärkung Methoden. Zellen ausgesetzt FACS in der Regel durchlaufen Mantel und Probe Linie Drücke im Bereich von ~ 9 – 14 Psi, je nach Düsengröße und Ereignisraten gewünscht. Darüber hinaus können die Ze…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (5R01MH094705 / 04 und R01MH109665-01, Z.J.H.), CSHL Robertson Neurowissenschaften Fonds (Z.J.H.) und ein NARSAD Postdoc-Stipendium (für A.P.) unterstützt.
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
Referências
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