Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq)

Summary

Ce protocole décrit le manuel de procédure pour isoler les neurones fluorescent étiquetés suivies in vitro l’amplification des ARNm axée sur la transcription pour l’ordonnancement de RNA seule cellule haute-profondeur de tri.

Abstract

Séquençage de RNA unicellulaires (RNA-seq) est maintenant un outil largement utilisé pour analyser l’expression des gènes. Plates-formes de RNA-sequencing unicellulaires commercialement disponibles traitent toutes les entrées des cellules sans discernement. Parfois, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) est utilisé en amont d’isoler une population spécifiquement marquée d’intérêt. Une limitation des FACS est la nécessité d’un nombre élevé de cellules d’entrée avec fractions nettement marquées, qui n’est pas pratique pour la collecte et le profilage des populations de neurone rares ou peu marqué par le cerveau de souris. Nous décrivons ici une méthode pour recueillir manuellement clairsemée fluorescent étiqueté de neurones fraîchement dissociées tissu de cerveau de souris. Ce processus permet de capturer des neurones seule avec haute pureté et intégration ultérieure avec un protocole de transcription basé sur l’amplification in vitro qui préserve les ratios de transcription endogène. Les auteurs décrivent une méthode de double amplification linéaire qui utilise des identificateurs de la molécule unique (UMIs) pour générer des comtes d’ARNm individuels. Deux séries de résultats d’amplification dans un degré élevé de détection de gènes par une cellule unique.

Introduction

Séquençage de RNA unicellulaires (RNA-seq) a transformé la transcriptomique études. Tandis que RNAseq de cellule unique à grande échelle peut être effectuée en utilisant une variété de techniques, telles que les gouttelettes^1,2, microfluidique³, nanogrids⁴et⁵de micropuits, la plupart des méthodes ne peut pas trier les types cellulaires définis qui expriment des fluorophores codés génétiquement. Pour isoler une population cellulaire select, cellule activée par fluorescence triant (FACS) est souvent utilisé pour trier des cellules marquées en mode single-cell. Cependant, les FACS a certaines restrictions et nécessite des étapes de traitement d’échantillon méticuleux. Tout d’abord, un grand nombre de cellules d’entrée est généralement nécessaires (souvent plusieurs millions de cellules par mL), avec une fraction significative (> 15 à 20 %) contenant la population marquée. Deuxièmement, des préparations de cellules peuvent exiger plusieurs séries d’étapes de centrifugation en gradient de densité pour éliminer la fraction gliale, débris et amas de cellule qui pourraient obstruer sinon la cellule buse ou le débit. Troisièmement, les FACS emploie généralement de coloration et de décoloration des étapes pour vivre/morts de coloration (p. ex., 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), l’iodure de propidium (PI) et des colorants Cytotracker), qui prennent plus de temps. Quatrièmement, comme une règle de tri (par exemple le DAPI et protéine fluorescente verte/rouge (GFP/DP)), habituellement deux échantillons de deux couleurs et un contrôle sont nécessaires, nécessitant un échantillon sans étiquette à traiter en plus de la souche de souris désiré. Cinquièmement, le filtrage est souvent exécuté plusieurs fois avant et Pendant l’échantillon tri pour empêcher proactivement les lignes échantillon bouché dans une machine de FACS. Sixièmement, le temps doit avoir accumulé dans des configurations de FACS plus couramment utilisées pour initialiser et stabiliser le flux de fluide et procéder au calage du droplet. Septième, contrôle des échantillons sont généralement exécuter dans l’ordre avant la collecte de l’échantillon réel à mettre en place des matrices de rémunération, rejet de doublet, définition gates, etc. utilisateurs soit procédez comme six et sept s’avance ou exiger le intervention d’un technicien en parallèle. Enfin, post-FACS, il y a souvent des mesures pour s’assurer que seulement marqué unique, les cellules sont présentes dans chaque puits ; par exemple, en cochant les échantillons dans une installation de projection haute teneur comme un imageur de plaque rapide.

Pour contourner les étapes décrites ci-dessus et de faciliter un relativement rapide, ciblé le séquençage d’une petite population de neurones fluorescent étiquetés, les auteurs décrivent un manuel de procédure suivie de deux manches d’une très sensibles in vitro de tri protocole d’amplification, appelée double in vitro transcription de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq). La génération de RNA d’amplification et de cDNA de bibliothèque est adaptée de Eberwine et al. ⁶ et Hashimshony et al. ⁷, avec certaines modifications en fonction des interneurones de souris qui ont de plus petits volumes cellulaires ; en outre, nous avons constaté également qu’il est tout aussi utile pour les neurones pyramidaux excitateurs.

Protocol

Toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par IACUC à Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8). 1. Manuel de tri des neurones de souris fluorescent étiquetés Tirer microcapillaries de verre (voir Table des matières) pour 10 à 15 µm sortie diamètre moyen d’un extracteur capillaire avec les paramètres suivants : chaleur : 508, tirer : vierge, vel : horaire vide, : vide. Fixer tube de silicone flexible…

Representative Results

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, GABAergiques neurones ont été manuellement triés (Figure 1) et ARN a été amplifié, puis transformé en une banque d’ADNc (Figure 2) et séquencé à haute profondeur8. Les produits amplifiés de RNA (aRNA) variaient entre 200 – 4 000 bp dans la taille, avec une distribution de pointe légèrement supérieure à 500 bp (Figure 3 a</…

Discussion

Le manuel de protocole de tri est adapté pour un séquençage de RNA encadré de neurone des populations qui sont soit peu marquées dans le cerveau de souris ou représentent une population de cellules rares qui est par ailleurs pas possible d’étudier à l’aide de la cellule active de haut débit méthodes de tri et d’amplification. Soumis à des FACS habituellement les cellules subissent des pressions de ligne gaine et échantillon de l’ordre de ~ 9 – 14 lb/po2, selon la taille de la buse et désiré taux d…

Materials

ERCC RNA Spike-In Control Mixes	Thermo Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher	Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer	New England Biolabs	Cat# E6105S
RNA MinElute kit	Qiagen	Cat# 74204
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	Cat# M0289
Poly nucleotide kinase	New England Biolabs	Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated	New England Biolabs	Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads	Beckman Coulter	Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads	Thermo Fisher	Cat# B23317
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
Message Amp II kit	Thermo Fisher	Cat# AM1751
Carbogen	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit	Illumina	Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip	Agilent	Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip	Agilent	Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100	Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F).	Leica	Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.	Warner instruments	Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratome	Thermo Microm	HM 650V
Vibratome tissue cooling unit	Thermo Microm	CU 65