CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi
Summary
Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.
Abstract
Gene pertürbasyon çalışmalar yoğun bireysel gen AML patogenezinde rol araştırmak için kullanılmaktadır. Tam gene bozulma ulaşmak için birçok bu çalışmalar yapmış karmaşık gen nakavt modelleri kullanın. Bu çalışmalar nakavt fareler ile genotip fenotip ilişkileri araştıran bir zarif ve zaman test sistemi sunarken, aday genler değerlendirmek için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem bu AML hücre çoğalması bir rol veya AML modelleri hayatta kalma oynamak paralel sorgu birden fazla aday gen hızlandırmak yardımcı olacaktır. Genom düzenleme teknolojileri son gelişmeler önemli ölçüde bizim yeteneği benzeri görülmemiş ölçekte bir genetik tedirginlikler gerçekleştirmek için gelişmiş var. Genom düzenleme bir tür hedef hücre genom hızlı ve etkili değişiklik yapma için kullanılan yöntemi CRISPR Cas9 göre sistemidir. Kolaylık ve CRISPR/Cas9-aracılı gen-silme ölçeklenebilirliğini yapar çok sayıda gen sorgulama için en cazip tekniklerden birini fenotipik deneyleri. Burada, nükleer silahların yayılmasına karşı önemli bir rol oynayabilir genlerin rolünün veya insan yaşama araştırmak için CRISPR/Cas9 aracılı gen-kesinti yüksek üretilen iş akış sitometresi-tabanlı rekabet deneyleri ile kombine kullanarak basit bir tahlil mevcut ve fare AML hücre hatları.
Introduction
Son birkaç on yıl çok sayıda araştırma çabalarının anahtar moleküler yolları akut miyeloid lösemi (AML) patogenezinde katkısı belirlenmesi üzerinde duruldu gördüm. Geleneksel olarak, gen-bozulma AML hücrelerdeki koşullu nakavt fareler veya kısa saç tokası RNA (shRNA) kullanılarak yapılmıştır. Nakavt fareler gen-silme spatio-temporal kontrolü için gelişmiş bir sistem sunarken, gen nakavt fareler üreten emek, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, gen-knockouts rekombinasyon stratejileri kullanarak kolayca ölçeklenebilir; değildir Bu stratejileri kendilerini de paralel olarak çeşitli genler sorgulama için borç yoktur. RNA müdahale yöntemleri için küçük müdahale RNA (siRNA) veya shRNA kullanarak knock-down endojen mRNA’ların keşfi sonra birçok grup AML belirli genlerin rolünü araştırmak için RNA müdahale teknikleri kullanmaya başladı. Fare ve insan AML hücreleri geleneksel transfection lipid tabanlı yöntemleri kullanarak transfect Rootkitler zor olduğundan, çoğu gen işlevi AML hücrelerinde çalışmak için lentivirally istihdam veya retrovirally kodlanmış shRNA çalışmalar. Son keşfi düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) kümelenmiş ve ilişkili Cas enzimler (CRISPR-Cas9) teknolojileri1,2,3gen hedefleme devrim. CRISPR-Cas9 kullanarak, belirli genler ve genomik bölgeler silinmiş, düzenlenemez veya verimliliği ve kolaylığı ile etiketlenmiş. CRISPR-Cas9-esaslı gen-düzenleme şimdi genotip fenotip ilişkileri farklı hücre tipleri basitlik, etkinlik ve bu tekniğin geniş uygulanabilirliği nedeniyle soruşturma için seçtiğiniz yöntemi olarak ortaya çıkıyor. CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemleri da yönteminin seçimi AML, sadece bireysel genler sorguluyor, ama birden çok gen dizilmiş veya havuza alınan genetik ekranlarda hedef için bir yol amaçlı olarak da paralel potansiyel olarak birkaç genleri araştıran hale geliyor AML-bağımlılıkları4,5,6.
Bu makale, gen-bozulma istikrarlı CRISPR-Cas9-aracılı gen-yüksek üretilen iş akış sitometresi tarafından takip düzenleme temel alan AML hücrelerinin büyümesini üzerinde etkisini ölçmek için bir basit rekabetçi büyüme tahlil açıklar. Bu yöntem basit, verimli ve ölçeklenebilir paralel AML hücrelerinde birkaç genlerin rolünün araştırılması için orta-den geçerek deneyler için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, biz aday genler akış sitometresi insan/antikorundan AML hücrelerinde (Şekil 5) kullanarak AML hücre hatlarında rolünü araştırmak için bir CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet büyüme tahlil yürütmek için detaylı bir protokol tanımlamak. Testin amacı iki ya da üç hafta boyunca bir orta-den geçerek ölçekte bakım gen silinmesiyle AML hücre çoğalması etkisini belirlemektir. Bazı kritik adımlar dikkatle açıklanan protokolünden yükseltme kolaylaştırmak için …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCW-Cas9 plazmid Eric Lander & David Sabatini (Addgene plazmid # 50661) ve pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – hediyesiydi W plazmid Yusa laboratuarından (Addgene plazmid #67974. Akış Sitometresi çekirdek SBP tıbbi Discovery Enstitüsü’nde akışı analizi ve sıralama ile zamanında yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bayan Tata Anıtı Vakfı A.D. için destek kabul etmek istiyoruz Ayrıca aşağıdaki finansman kaynakları destek kabul etmek istiyoruz: NIH/ncı P30 CA030199 Kanser Merkezi Grant sponsorluğunda, V-Vakfı ve San Diego ncı kanser merkezleri (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
Referências
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
