基于 crispr-cas9 的竞争检测对遗传依赖性的调查
Summary
这份手稿描述了一种基于群集的规则间的短半突 (crispr) crispr-cas9 方法, 用于简单而快速地调查多个候选基因在急性髓样白血病 (aml) 细胞增殖中的作用。并行。这种技术是可扩展的, 也可以应用于其他癌症细胞系。
Abstract
基因摄动研究已被广泛用于研究单个基因在 aml 发病机制中的作用。为了实现完全的基因破坏, 这些研究中的许多都利用了复杂的基因敲除模型。虽然这些针对敲除小鼠的研究为研究基因组学与表型的关系提供了一个优雅且久经考验的系统, 但这是一种快速且可扩展的方法, 用于评估在 aml 模型中发挥 aml 细胞增殖或存活作用的候选基因将有助于加速对多个候选基因的平行审讯。最近在基因组编辑技术方面取得的进展大大提高了我们以前所未有的规模执行基因扰动的能力。其中一个基因组编辑系统是基于 crispr-cas9 的方法, 可用于在目标细胞基因组中进行快速有效的改变。crisprs9 介导的基因缺失的易用性和可扩展性使其成为在表型检测中询问大量基因的最有吸引力的技术之一。在这里, 我们提出了一个简单的方法, 使用 crispr/cas9 介导的基因破坏结合高通量流-细胞仪的竞争分析, 以研究基因的作用, 可能发挥重要作用, 在人类的增殖或生存和小鼠 aml 细胞系。
Introduction
在过去的几十年里, 已经有了许多研究工作, 重点是确定关键分子途径在急性髓系白血病 (aml) 发病机制中的贡献。传统上, aml 细胞中的基因破坏是使用有条件的敲除小鼠或短发针 rna (shrna) 进行的。虽然敲除小鼠提供了一个复杂的系统, 用于在时空上控制基因缺失, 而产生基因敲除小鼠则是劳动密集型、耗时且昂贵的。此外, 使用重组策略的基因淘汰也不容易扩展;这些策略并不适合平行地对几个基因进行审讯。在发现 rna 干扰方法以使用小干扰 rna (sirna) 或 shrna 敲除内源性 mrna 后, 许多组开始使用 rna 干扰技术来研究特定基因在 aml 中的作用。由于使用传统的脂质转染方法很难转染小鼠和人的 aml 细胞, 因此大多数研究都使用 lentiv 或逆转录病毒编码的 shrna 来研究 aml 细胞的基因功能。最近发现的聚集定期间隔的短回文重复 (crispr) 和相关的 cas 核酸酶 (crispr-cas9) 使基因靶向技术1、2、3发生了革命性的变化。使用 crispr-cas9, 可以删除、编辑或标记特定的基因或基因组区域, 高效和轻松。基于 crispr-cas9 的基因编辑由于该技术的简单性、有效性和广泛适用性, 目前正在成为研究不同细胞类型中基因组学到表型关系的首选方法。基于 crispr-cas9 的方法也正在成为 aml 中的首选方法, 这不仅是为了询问单个基因, 也是一种针对排列或汇集的基因屏幕中的多个基因的方法, 目的是将多个基因作为潜在的平行调查aml 依赖关系 4,5,6。
在这篇手稿中, 我们描述了一个简单的竞争增长分析, 用于测量基因破坏对 aml 细胞生长的影响, 基于稳定的 crispr-cas9 介导的基因编辑, 然后是高通量流式细胞术。该方法简单、高效, 可扩展到中等吞吐量实验, 用于研究多个基因在反洗钱细胞中的并行作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这篇手稿中, 我们描述了一个详细的协议, 用于进行基于 crispr-cas9 的竞争生长检测, 以研究候选基因在 aml 细胞系中的作用, 使用流式细胞仪在人/小鼠 aml 细胞中的作用 (图 5)。该分析的目的是在中等吞吐量的范围内, 确定基因缺失对维持两到三周反洗钱细胞增殖的影响。需要认真遵循一些关键步骤, 以促进扩大所述议定书的规模。在 cas9 慢病毒的生产中, 有必要通过0.45μm 过?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pcw-cas9 质粒是 eric lander & david sabatini (adgene 质粒 # 50661) 和来自 yusa 实验室的 pklv2-U6gRNA5(BbsI) pgkpuro2abfp-w 质粒 (adusa 基因质粒 #67974) 赠送的礼物。我们要感谢 sbp 医疗发现研究所的流式细胞仪核心在流量分析和分类方面的及时帮助。我们要感谢塔塔夫人纪念基金会对 a. d. 的支持。我们还要感谢以下资金来源的支持: nhh/nci p30 c03030199 癌症中心赞助的赠款、v 基金会和圣地亚哥 nci 癌症中心 (c3) #PTC2017to。
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
Referências
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