Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR
Summary
Ce manuscrit décrit une méthode de base CRISPR-Cas9 de groupés régulièrement entrecoupées court palindromique répète (CRISPR) pour une enquête rapide et simple du rôle de plusieurs gènes candidats à la prolifération des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) Parallèlement. Cette technique est évolutive et peut être appliquée dans les autres lignées cellulaires cancéreuses ainsi.
Abstract
Études de perturbation de gènes ont été utilisés intensivement pour enquêter sur le rôle des gènes individuels dans la pathogenèse de l’AML. Pour la réalisation complète du gène perturbation, beaucoup de ces études ont fait l’utilisation de modèles knock-out gène complexe. Bien que ces études sur des souris knockout offrent un système élégant et ayant fait leurs preuves pour enquêter sur les relations génotype-phénotype à, une méthode rapide et évolutive pour l’évaluation des gènes candidats qui jouent un rôle dans la prolifération cellulaire AML ou la survie dans les modèles AML aidera à accélérer l’interrogatoire parallèle de plusieurs gènes candidats. Les progrès récents dans les technologies de modification du génome ont amélioré considérablement notre capacité à effectuer des perturbations génétiques à une échelle sans précédent. Un tel système de modification du génome est la méthode CRISPR dotés de Cas9 qui permet d’effectuer des modifications rapides et efficaces dans le génome de cellules cibles. La simplicité et l’évolutivité des CRISPR/Cas9-mediated gene-suppression rend une des techniques plus attrayants pour l’interrogatoire d’un grand nombre de gènes dans des tests phénotypiques. Nous présentons ici un essai simple avec CRISPR/Cas9 médiée par gène-perturbation combinée à haut-débit débit-cytometry-concurrence fondée sur les dosages d’enquêter sur le rôle des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans la prolifération ou la survie de l’homme et lignées de cellules murines AML.
Introduction
Les dernières décennies ont vu les nombreux efforts de recherche axés sur l’identification de la contribution des principales voies moléculaires dans la pathogenèse de la leucémie myéloïde aiguë (AML). Traditionnellement, disruption de génique dans les cellules de Lam a été réalisée à l’aide de la souris knock-out conditionnel ou court-hairpin RNA (Sharn). Tandis que chez des souris knockout offrent un système sophistiqué de contrôle spatio-temporelle de la délétion de gène, générant des souris knockout gène est fastidieux, long et coûteux. En outre, gène-coups de grâce à l’aide de stratégies de recombinaison n’est pas facilement évolutive ; ces stratégies ne se prêtent pas bien à l’interrogatoire de plusieurs gènes en parallèle. Après la découverte de méthodes d’interférence ARN à l’ARNm endogène de précipitation à l’aide de petits ARN interférents (siARN) ou Sharn, nombreux groupes a commencé à utiliser des techniques de RNA interference pour enquêter sur le rôle des gènes spécifiques dans AML. Puisque les cellules AML murins et humains sont notoirement difficiles à transfecter à l’aide de méthodes de transfection de lipides à base traditionnelle, la plupart des études Sharn lentivirally salarié ou codé en retrovirally pour étudier la fonction des gènes dans les cellules de l’AML. La découverte récente de cluster régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR) et les nucléases de Cas connexes (CRISPR-Cas9) a révolutionné les technologies de ciblage de gène1,2,3. En utilisant CRISPR-Cas9, certains gènes ou régions génomiques peuvent être supprimées, sous la direction ou le tag avec efficacité et facilité. CRISPR Cas9-gène-modification basée est en train d’émerger comme la méthode de choix pour l’étude des relations génotype-phénotype à dans les types de cellules différentes en raison de la simplicité, l’efficacité et large applicabilité de cette technique. Méthodes CRISPR dotés de Cas9 deviennent aussi la méthode de choix des AML, non seulement pour interroger des gènes individuels, mais aussi comme une façon de cibler des gènes multiples dans les écrans génétiques rangés ou centralisées visant à enquêter sur plusieurs gènes en parallèle comme potentiel AML-dépendances4,5,6.
Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un dosage simple croissance compétitive pour mesurer l’impact de la gène-perturbation sur la croissance des cellules de l’AML, selon stable CRISPR-Cas9-mediated gene édition suivie par cytométrie en flux haut débit. Cette méthode est simple, efficace et évolutive à débit moyen des expériences pour étudier le rôle de plusieurs gènes en parallèle dans les cellules de l’AML.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour effectuer un test de croissance compétitive CRISPR dotés de Cas9 pour enquêter sur le rôle des gènes candidats dans des lignées cellulaires AML cytométrie-dans les cellules humaines/murin AML (Figure 5). L’objectif du test est d’identifier l’effet de la suppression du gène sur l’entretien de la prolifération cellulaire AML pendant deux à trois semaines sur une échelle de débit moyen. Certaines étapes …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le plasmide de pCW-Cas9 était un cadeau de Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmide 50661 #) et le pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – plasmide W du labo Yusa (plasmide #67974 de Addgene. Nous tenons à remercier le noyau de la cytométrie en flux SBP Medical Discovery Institute pour une aide opportune avec analyse en flux et tri. Nous tenons à souligner le soutien de la Lady Tata Memorial Foundation AP. j.-c. Nous tenons à remercier également les sources de financement suivantes : NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center parrainé par Grant, la Fondation-V et les San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
Referências
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
